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自噬相关蛋白CfAtg8在果生刺盘孢中的功能分析 被引量:8
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作者 郭源 李河 +2 位作者 周国英 刘君昂 张盛培 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期592-602,共11页
油茶炭疽病是由刺盘孢属Colletotrichum真菌引起的重要病害,在中国各油茶产区均有发生,严重威胁茶油的产量与品质。前期发现果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病的优势致病菌,自噬相关蛋白Atg8在果生刺盘孢中的生物学功能... 油茶炭疽病是由刺盘孢属Colletotrichum真菌引起的重要病害,在中国各油茶产区均有发生,严重威胁茶油的产量与品质。前期发现果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病的优势致病菌,自噬相关蛋白Atg8在果生刺盘孢中的生物学功能尚不清楚。本研究根据同源重组的原理及PEG介导的原生质体转化方法,获得了CfATG8基因敲除突变体及其互补菌株。进一步通过生物学表型分析,发现突变体生长减慢、产孢量减少、附着胞形成率降低、对细胞壁完整性胁迫耐受性降低,并且丧失对油茶的致病性。上述结果表明,CfAtg8参与调控果生刺盘孢的营养生长、无性繁殖、附着胞形成、对外界胁迫应答及致病过程。 展开更多
关键词 油茶 果生刺盘孢 细胞自噬 自噬相关蛋白cfatg8 致病性
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刚地弓形虫自噬相关蛋白8(TgAtg8)多克隆抗体制备及初步应用 被引量:1
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作者 谭峰 华倩倩 +2 位作者 李星潘 李相志 梁韶晖 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期130-134,共5页
目的制备、评价特异性抗刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)自噬相关蛋白8(autophagy protein 8,TgAtg8)多克隆抗体。方法生物信息学方法分析弓形虫基因组中自噬相关蛋白的基因序列和氨基酸序列。以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增T... 目的制备、评价特异性抗刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)自噬相关蛋白8(autophagy protein 8,TgAtg8)多克隆抗体。方法生物信息学方法分析弓形虫基因组中自噬相关蛋白的基因序列和氨基酸序列。以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgAtg8编码基因,克隆入pGEX-6p-1载体,构建pGEX-6p-1-TgAtg8重组质粒,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签亲和层析法纯化表达产物。以纯化的TgAtg8蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,获得特异性抗TgAtg8多克隆抗体。以制备的多克隆抗体作为一抗,进行Western blotting分析和间接免疫荧光(IFA)检测。结果双酶切和测序结果证实,原核表达质粒pGEX-6p-1-TgAtg8构建成功。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,TgAtg8蛋白在E.coli BL21中获得高效表达,其融合蛋白相对分子质量(Mr)约40 000,与理论值相近。Western blotting结果证实,所制备的多克隆抗体能特异性识别融合蛋白TgAtg8和虫株体内天然的TgAtg8蛋白。IFA实验表明,TgAtg8均匀分布于虫体胞浆中,但在自噬诱导培养后,TgAtg8逐渐聚集成颗粒状。结论制备的特异性抗TgAtg8多克隆抗体可用于检测虫体内TgAtg8蛋白在弓形虫自噬形成过程中的变化情况。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 自噬相关蛋白8 细胞自噬 多克隆抗体
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心肌细胞肥大时线粒体三磷酸腺苷敏感钾通道和线粒体自噬的变化
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作者 程晓蔚 朱庆磊 《中华老年多器官疾病杂志》 2023年第5期372-376,共5页
目的 研究心肌细胞肥大时线粒体三磷酸腺苷(ATP)敏感钾通道亚基及线粒体自噬的变化。方法 选择出生24 h的大鼠乳鼠体外培养原代心肌细胞,将其随机分为2组。对照组细胞采用加含10%胎牛血清的高糖培养基进行培养,模型组细胞在含10%胎牛血... 目的 研究心肌细胞肥大时线粒体三磷酸腺苷(ATP)敏感钾通道亚基及线粒体自噬的变化。方法 选择出生24 h的大鼠乳鼠体外培养原代心肌细胞,将其随机分为2组。对照组细胞采用加含10%胎牛血清的高糖培养基进行培养,模型组细胞在含10%胎牛血清的高糖培养基中加入异丙肾上腺素(ISO)140μmol/L处理48 h。酶联免疫吸附法检测心肌细胞培养上清液氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)浓度,实时荧光定量聚合酶链式反应检测心房钠尿肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)、内向整流钾通道6.1(Kir6.1)和自噬相关基因8(Atg8)的mRNA表达,蛋白免疫印迹法检测Kir6.1和线粒体自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)和FUN14结构域蛋白1(FUNDC1)的表达。采用GraphPad Prism v9.0.0软件进行数据分析。组间比较采用t检验。结果 经ISO处理后,模型组心肌细胞上清液NT-proBNP浓度[(1 699.43䥺SymbolqB@407.01)pg/ml]显著高于对照组[(808.68䥺SymbolqB@91.46)pg/ml],标志性肥大基因ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达增加,Kir6.1和Atg8的mRNA表达显著降低,线粒体ATP敏感钾通道蛋白Kir6.1和线粒体自噬相关蛋白LC3,FUNDC1表达明显下降(均P<0.05)。结论 心肌细胞肥大时线粒体ATP敏感钾通道表达和线粒体自噬水平均降低。 展开更多
关键词 心肌细胞肥大 异丙肾上腺素 内向整流钾通道6.1 自噬相关基因8 微管相关蛋白1轻链3 FUN14结构域蛋白1
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白纹伊蚊自噬基因ATG8蛋白多克隆抗体的制备及应用
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作者 何珊 肖秋秋 +4 位作者 石梦婷 李威仪 彭哲慧 程金芝 吴家红 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2023年第7期787-792,共6页
目的通过原核表达系统制备白纹伊蚊(Aedes albopictus,Aa)ATG8,免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,并验证抗体的实用性。方法从白纹伊蚊Aa23细胞中提取cDNA,通过PCR扩增AaATG8基因片段,然后与载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-AaATG8... 目的通过原核表达系统制备白纹伊蚊(Aedes albopictus,Aa)ATG8,免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,并验证抗体的实用性。方法从白纹伊蚊Aa23细胞中提取cDNA,通过PCR扩增AaATG8基因片段,然后与载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-AaATG8并转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR鉴定,提取质粒进行测序鉴定。再将重组质粒转化到大肠埃希菌BL21感受态细胞,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白rAa-ATG8,纯化透析后免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA检测抗体效价,并以该抗体为一抗采用Western blot检测不同物种ATG8蛋白的表达。结果成功构建原核表达载体PET30a-AaATG8并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA检测其血清抗体效价为1∶640000;Western blot显示rAa-ATG8多克隆抗体可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,反应条带位于18、16或14 ku处。结论成功获得高效价的rAa-ATG8多克隆抗体,该抗体不仅可用于检测白纹伊蚊ATG8蛋白,还可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,为研究自噬在蚊虫以及其他物种中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 白纹伊蚊 自噬相关蛋白8/ATG8 原核表达 抗体制备
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囊泡相关膜蛋白8的研究进展
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作者 张鑫 侯雪阳(综述) +1 位作者 张瑞 唐景峰(审校) 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1143-1148,共6页
膜融合对真核生物的诸多生命活动至关重要,需要不同的囊泡转运蛋白互相配合,从而特异性协调并辅助不同生物膜的融合,这些囊泡转运蛋白高度保守。囊泡相关膜蛋白8(vesicle associated membrane protein 8,VAMP8)主要定位于囊泡膜和溶酶体... 膜融合对真核生物的诸多生命活动至关重要,需要不同的囊泡转运蛋白互相配合,从而特异性协调并辅助不同生物膜的融合,这些囊泡转运蛋白高度保守。囊泡相关膜蛋白8(vesicle associated membrane protein 8,VAMP8)主要定位于囊泡膜和溶酶体膜,其在多种不同生物膜的融合中发挥重要作用。本文就VAMP8的分子结构、转录调控和翻译后修饰、生物学功能及其与人类疾病相关性的研究进展作一综述,以期为治疗相关疾病和开发有效的VAMP8靶点药物提供新思路。 展开更多
关键词 囊泡相关蛋白8 自噬 胞吐 转录调控 翻译后修饰
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恶性疟原虫自噬相关蛋白8基因原核重组表达及多克隆抗体制备
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作者 李缜 邹洋 +4 位作者 黄敏君 贾永根 闫爱霞 李晶晶 谷俊朝 《中国热带医学》 CAS 2019年第5期411-415,429,共6页
目的通过pET-41 Ek/LIC载体在大肠杆菌工程菌中重组表达恶性疟原虫自噬相关蛋白8(PfAtg8)基因的重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,并用蛋白免疫法制备小鼠抗自噬相关蛋白8(PfAtg8)的多克隆抗体,并验证其效价。方法体外培养恶性疟原虫3D7株... 目的通过pET-41 Ek/LIC载体在大肠杆菌工程菌中重组表达恶性疟原虫自噬相关蛋白8(PfAtg8)基因的重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,并用蛋白免疫法制备小鼠抗自噬相关蛋白8(PfAtg8)的多克隆抗体,并验证其效价。方法体外培养恶性疟原虫3D7株,并提取DNA,PCR扩增PfAtg8序列全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^(TM)(DE3)PLysS工程菌中诱导表达重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,蛋白免疫法制备鼠抗PfAtg8的多克隆抗体并用Western blots和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进行效价验证。结果 PCR扩增PfAtg8基因并插入pET-41 Ek/LIC载体,转化入大肠杆菌。诱导表达并纯化重组蛋白,进而利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经验证该抗体可对重组蛋白进行特异性识别,且效价可达1∶100 000。结论成功表达、纯化了GST-PfAtg8-6×His重组蛋白,并免疫小鼠获得多克隆抗体血清。 展开更多
关键词 恶性疟原虫 自噬相关蛋白8 原核表达 多克隆抗体
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CALCOCO1与恶性肿瘤的发生发展
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作者 贾楠 王志莲 《基础医学与临床》 2023年第11期1733-1737,共5页
钙结合和螺旋结构域1(CALCOCO1)是近年来新发现的一种自噬调节蛋白,其在选择性自噬中有重要作用。编码基因CALCOCO1位于12q13.13,其编码的CALCOCO1蛋白,通过与ATG8家族蛋白结合,锚定于内质网及高尔基体上,参与内质网及高尔基体自噬,从... 钙结合和螺旋结构域1(CALCOCO1)是近年来新发现的一种自噬调节蛋白,其在选择性自噬中有重要作用。编码基因CALCOCO1位于12q13.13,其编码的CALCOCO1蛋白,通过与ATG8家族蛋白结合,锚定于内质网及高尔基体上,参与内质网及高尔基体自噬,从而参与选择性自噬和早期阶段的自噬体形成。当mTOR通路被激活后,mTOR可通过自噬依赖途径调节CALCOCO1的表达。CALCOCO1在恶性肿瘤的发生、转移及治疗等方面都发挥作用。 展开更多
关键词 自噬 钙结合和螺旋结构域1(CALCOCO1) 自噬相关蛋白8家族(ATG8) 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) 肿瘤
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细胞自噬相关蛋白在大鼠脾脏撞击伤后12小时内脾组织中的表达 被引量:1
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作者 欧阳骏骏 牛玉林 《中国临床研究》 CAS 2019年第1期18-22,共5页
目的观察自噬基因相关蛋白在大鼠脾脏撞击伤后12 h内脾组织内的表达情况。方法选用清洁级健康SD大鼠20只,随机分为正常对照组(A组)、创伤后2 h组(B组)、创伤后8 h组(C组)、创伤后12 h组(D组),每组5只。B、C、D组利用生物撞击机建立脾脏... 目的观察自噬基因相关蛋白在大鼠脾脏撞击伤后12 h内脾组织内的表达情况。方法选用清洁级健康SD大鼠20只,随机分为正常对照组(A组)、创伤后2 h组(B组)、创伤后8 h组(C组)、创伤后12 h组(D组),每组5只。B、C、D组利用生物撞击机建立脾脏撞击伤模型,A组只麻醉不撞击,麻醉后立即处死取出脾脏,B、C、D组分别于撞击后相应时间取出脾脏,评估脾脏出现损伤的程度。创伤脾组织标本进行HE染色,显微镜下观察受损脾组织的特征。大体标本观察造模是否成功。采用免疫组织化学法及Western blot法检测各组脾组织酵母自噬相关基因Atg6的同源物(Beclin1)、酵母自噬相关基因Atg8的同源物微管相关蛋白1轻链蛋白3(LC3)蛋白的表达。结果 (1)脾撞击伤模型均造模成功。同一撞击力度下不同受伤时间模型组大鼠脾脏裂伤长度和深度基本一致(P均> 0. 05)。(2) HE染色显示模型组脾组织符合脾破裂征象。(3)免疫组织化学法及Western blot法检测显示,模型大鼠随创伤后时间推移(2 h组→8 h组→12 h组),其脾组织Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相对表达量递升(P均<0. 05),且模型大鼠各时间组均高于对照组(P均<0. 05)。结论脾脏撞击伤可导致脾组织自噬水平的上升;脾脏撞击伤后12 h内脾组织自噬相关蛋白水平随时间的推移,表达逐渐升高。 展开更多
关键词 脾脏撞击伤 自噬 酵母自噬相关基因Atg6的同源物 酵母自噬相关基因Atg8的同源物微管相关蛋白1轻链蛋白3
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囊泡相关膜蛋白8在结肠癌中的表达及临床意义
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作者 廖真 张良敏 晏锐 《中国普通外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1411-1416,共6页
目的:探讨囊泡相关膜蛋白8(VAMP8)在结肠癌组织中的表达及其临床意义。方法:收集42例结肠癌患者癌组织及癌旁正常组织标本,用免疫组化法检测VAMP8蛋白的阳性表达率,分析其表达与结肠癌临床病理特征之间的关系;并选择其中12对标本,用q RT... 目的:探讨囊泡相关膜蛋白8(VAMP8)在结肠癌组织中的表达及其临床意义。方法:收集42例结肠癌患者癌组织及癌旁正常组织标本,用免疫组化法检测VAMP8蛋白的阳性表达率,分析其表达与结肠癌临床病理特征之间的关系;并选择其中12对标本,用q RT-PCR与Western blot法检测VAMP8 m RNA与蛋白的表达量。结果:q RT-PCR及Western blot检测显示,9对标本的结肠癌组织VAMP8 m RNA与蛋白表达量明显高于其对应的癌旁组织(均P<0.05);免疫组化结果显示,VAMP8在结肠癌组织中的阳性率明显高于癌旁组织(73.8%vs.42.9%;χ2=8.28,P<0.01),且VAMP8的表达与肿瘤的分化程度、Dukes分期及淋巴结转移情况有关(均P<0.05)。结论:VAMP8在结肠癌组织中表达上调,提示VAMP8可能通过调节自噬/溶酶体途径促进结肠癌的恶性进展与转移。 展开更多
关键词 结肠肿瘤 囊泡相关蛋白8 自噬 肿瘤侵润
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肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1在顺铂诱导的急性肾损伤模型中的表达 被引量:1
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作者 刘力畅 索东阳 +3 位作者 丁瑜 万象 张洋 杨向东 《中华肾脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期543-549,共7页
目的探讨肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1(TIPE1)在顺铂诱导的急性肾损伤(AKI)动物模型及细胞中的表达及作用。方法12只6~8周龄雄性C57BL/6小鼠被随机分为对照组和模型组,模型组小鼠接受20 mg/kg顺铂单次腹腔注射,对照组给予单次20 mg/k... 目的探讨肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1(TIPE1)在顺铂诱导的急性肾损伤(AKI)动物模型及细胞中的表达及作用。方法12只6~8周龄雄性C57BL/6小鼠被随机分为对照组和模型组,模型组小鼠接受20 mg/kg顺铂单次腹腔注射,对照组给予单次20 mg/kg生理盐水腹腔注射,5 d后处死小鼠并留取血清和肾脏标本。检测Scr、血BUN水平;HE染色法观察小鼠肾组织病理学改变;免疫组化法检测肾组织TIPE1的表达;实时荧光定量PCR法检测小鼠肾组织TIPE1 mRNA相对表达量;Western印迹法检测肾组织TIPE1和小管损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)相对表达量。20μmol/L顺铂刺激人肾近端小管上皮细胞(HK-2)0、6、12、24 h构建体外顺铂诱导急性肾损伤细胞模型,实时荧光定量PCR法及Western印迹法检测HK-2细胞TIPE1 mRNA和蛋白的表达水平。用包含TIPE1 siRNA序列的慢病毒靶向沉默TIPE1基因,20μmol/L顺铂处理TIPE1稳定敲除的HK-2细胞株24 h,Western印迹法检测HK-2细胞NGAL、自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链(LC)3及Beclin1的表达。结果与对照组相比,模型组小鼠肾组织中TIPE1 mRNA及蛋白表达量、NGAL蛋白表达量显著升高(均P<0.05);HK-2细胞TIPE1 mRNA及蛋白表达量随顺铂处理时间延长而增加(均P<0.05)。慢病毒干扰HK-2的TIPE1表达后,TIPE1 siRNA组的HK-2细胞NGAL、LC3-Ⅱ及Beclin1蛋白表达较阴性对照Scramble组显著升高(均P<0.05)。结论急性肾损伤模型中TIPE1 mRNA及蛋白表达增加。沉默TIPE1表达后,早期肾小管损伤标志物及自噬相关蛋白表达增加,提示过度自噬加重肾小管损伤,TIPE1可能参与了急性肾损伤的发病过程。 展开更多
关键词 急性肾损伤 自噬 顺铂 肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白
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MRP8通过NF-κB信号通路调控痛风细胞模型中IL-1β的表达 被引量:3
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作者 赵璐 孙俊波 魏桂梅 《山东大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2015年第6期44-47,共4页
目的研究髓样相关蛋白8(MRP8)在痛风中的作用及其机制。方法单钠尿酸盐(MSU)结晶诱导巨噬细胞产生痛风模型,检测诱导后巨噬细胞中MRP8的水平。MRP8 si RNA转染巨噬细胞,Western blotting检测沉默效果及MRP8沉默对核转录因子κB(NF-κB)... 目的研究髓样相关蛋白8(MRP8)在痛风中的作用及其机制。方法单钠尿酸盐(MSU)结晶诱导巨噬细胞产生痛风模型,检测诱导后巨噬细胞中MRP8的水平。MRP8 si RNA转染巨噬细胞,Western blotting检测沉默效果及MRP8沉默对核转录因子κB(NF-κB)信号通路中的NF-κB和NF-κB抑制蛋白(I-κB)表达的影响,ELISA法检测MRP8沉默对炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)分泌的影响。结果 MSU可诱导巨噬细胞高表达MRP8(P<0.01);MRP8 si RNA转染能有效干扰巨噬细胞中MRP8的表达。MPR8沉默后巨噬细胞中IL-1β的分泌明显减少(P<0.05),同时NF-κB表达下调,I-κB表达上调。结论 MRP8参与MSU诱导痛风的炎性因子IL-1β的释放过程,且有可能通过NF-κB信号通路调控IL-1β的分泌来实现。 展开更多
关键词 髓样相关蛋白8 细胞 白细胞介素-1Β 核转录因子ΚB 核转录因子κB抑制蛋白
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