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缺氧促进5HRE和AFPp调控的NTR/CB1954自杀基因系统特异杀伤HepG2细胞 被引量:5
1
作者 王炜 孙学军 +1 位作者 郑见宝 禄韶英 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期125-129,共5页
目的:研究5拷贝缺氧反应元件(5HRE)和甲胎蛋白启动子(AFPp)联合调控的自杀基因系统硝基还原酶/CB1954(nitro-reductase/CB1954,NTR/CB1954)在缺氧环境下对人肝癌细胞株HepG2生长的抑制作用。方法:利用5HRE作为增强子和AFPp构成联合调控... 目的:研究5拷贝缺氧反应元件(5HRE)和甲胎蛋白启动子(AFPp)联合调控的自杀基因系统硝基还原酶/CB1954(nitro-reductase/CB1954,NTR/CB1954)在缺氧环境下对人肝癌细胞株HepG2生长的抑制作用。方法:利用5HRE作为增强子和AFPp构成联合调控元件,与自杀基因NTR构成真核表达载体。将载体转染AFP阳性的人肝癌细胞株HepG2及AFP阴性的人胃癌细胞株MKN45,利用G418筛选稳定转染的细胞。用RT-PCR和Westernblotting检测NTR的表达。将前体药物CB1954加入稳定表达NTR基因的细胞,用MTT法观察其毒性代谢产物4-羟胺还原产物对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果:成功筛选出稳定表达NTR的单克隆HepG2细胞和MKN45细胞。RT-PCR和Westernblotting证实单克隆HepG2细胞中NTR在mRNA和蛋白水平的表达,且缺氧环境中的表达量更高;单克隆MKN45细胞在常氧和缺氧环境中均无NTR表达。MTT法检测发现,缺氧环境下NTR基因能有效地活化前体药物CB1954,剂量依赖性地抑制NTR阳性的HepG2细胞的生长(P<0.05);但对MKN45细胞和野生型HepG2细胞无抑制作用。结论:5HRE和AFPp双重调控的NTR/CB1954自杀基因系统在体外缺氧环境下可促进对人肝癌细胞株HepG2靶向性杀伤作用。 展开更多
关键词 肝肿瘤 NTR/CB1954自杀基因系统 缺氧环境 AFP
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受强力霉素调节的自杀基因表达载体系统的构建和在乳腺癌细胞株(MCF-7)的表达 被引量:5
2
作者 罗赛群 胡维新 +2 位作者 易伟峰 曾赵军 陈迁 《生命科学研究》 CAS CSCD 2002年第2期137-141,共5页
自杀基因治疗是恶性肿瘤基因治疗中最常用的途径之一 .以逆转录病毒载体———pRevTRE为基础进行载体构建 ,首先使用PCR技术对单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSVtk)进行扩增 ,将HSVtk基因插入到pRe vTRE ,形成重组载体pRevTRE/HSVtk ,用磷... 自杀基因治疗是恶性肿瘤基因治疗中最常用的途径之一 .以逆转录病毒载体———pRevTRE为基础进行载体构建 ,首先使用PCR技术对单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSVtk)进行扩增 ,将HSVtk基因插入到pRe vTRE ,形成重组载体pRevTRE/HSVtk ,用磷酸钙共沉淀法 ,经过两轮转染 ,分别将pRevTRE/HSVtk和pRevTet On质粒导入乳腺癌细胞株 (MCF 7) .经过潮霉素B(HygromycinB)和G418筛选 ,建立了一株稳定的受四环素衍生物———强力霉素 (Doxycycline ,Dox)调控、表达HSVtk基因产物的人乳腺癌细胞株MCF/TRE/tk/Tet On .HSVtk基因表达产物可以将无毒性的药物前体Ganciclovir (GCV)转变成一种有毒的代谢产物 ,从而杀死乳腺癌细胞株(MCF 7) ,达到基因治疗的目的 . 展开更多
关键词 强力霉素 调节 自杀基因表达载体系统 乳腺癌细胞株 MCF-7 表达 基因治疗 旁观者效应
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大鼠肝癌细胞HSV-tk/GCV自杀基因系统的构建及其旁观者效应 被引量:7
3
作者 谭宇蕙 吴映雅 +3 位作者 杜标炎 胡岳山 赵鹏 李杰芬 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2005年第17期2069-2073,共5页
目的:构建针对大鼠肝癌细胞的HSV-tk/GCV(以下简称tk/GCV系统)自杀基因治疗系统,建立比较tk/GCV系统作用效果及其旁观者效应大小的细胞模型和检测方法.方法:用包装细胞PT67/tk分泌的重组逆转录病毒的活性颗粒感染大鼠肝癌CBRH7919细胞,... 目的:构建针对大鼠肝癌细胞的HSV-tk/GCV(以下简称tk/GCV系统)自杀基因治疗系统,建立比较tk/GCV系统作用效果及其旁观者效应大小的细胞模型和检测方法.方法:用包装细胞PT67/tk分泌的重组逆转录病毒的活性颗粒感染大鼠肝癌CBRH7919细胞,用G418筛选3wk获得高耐药性的重组子CBRH7919/tk,扩大培养.提取CBRH7919(tk-),CBRH7919/tk(tk+)细胞的DNA,把HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后,与2种DNA及阳性对照DNA进行点杂交,以检测tk+细胞的DNA是否整合有HSV-tk基因.用0.1、1、10、50、100mg/L的GCV体外作用于tk-、tk+细胞,MTT检测存活率.用GCV体外分别作用于含不同比例tk+细胞的tk+、tk-混合细胞,MTT检测存活率,比较分析各组旁观者效应大小,确定后续实验的合适tk+比例.结果:用G418筛选3wk后获到高耐药性的CBRH7919/tk(tk+)重组细胞.HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后进行点杂交,检测到tk+细胞DNA上已整合有HSV-tk基因,而tk-细胞DNA不含HSV-tk基因.GCV对tk+细胞生长抑制和细胞毒作用明显,而且有浓度、时间依赖性,而tk-细胞对GCV不敏感,说明HSV-tk基因已表达且表达产物具有生物学活性.GCV对含5%和10%tk+的混合细胞杀伤率分别为6.0%和25.2%,结果表明5-10%的tk+混合比例下自杀基因系统自身的旁观者效应较低,而且用MTT检测旁观者效应大小时灵敏度比较高,可作为后续研究中药活性成分对旁观者效应增效作用的tk+、tk-混合比例.结论:成功构建了针对大鼠肝癌的HSV1-tk/GCV自杀基因治疗系统,建立了体外快速筛选旁观者效应增效药物的稳定有效的细胞模型和检测方法. 展开更多
关键词 HSV1-tk/GCV自杀基因系统 肝癌 大鼠 旁观者 效应
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HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应 被引量:5
4
作者 李涛 张虹 +4 位作者 王骞 梁峰 李伟 李贵刚 卢运萍 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期533-537,共5页
目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 /更昔洛韦 (herpessimplexvirusthymidinekinase /gancyclovir,HSV tk/GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma ,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用脂质体... 目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 /更昔洛韦 (herpessimplexvirusthymidinekinase /gancyclovir,HSV tk/GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma ,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用脂质体将pCMV/hytk IRES hrGFP质粒导入HXO Rb44细胞株。用潮霉素筛选出阳性细胞克隆并命名为HXO Rb44/tk。RT PCR鉴定hytk基因在HXO Rb44/tk细胞中的转录结果。比较HXO Rb44和HXO Rb44/tk细胞的形态特征及生长特性。通过MTT法检测GCV对不同比例HXO Rb44/tk和HXO Rb44混合细胞的杀伤作用 (“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果 HXO Rb44/tk细胞经RT PCR可检测出 5 30bp的hytk基因片段。HXO Rb44/tk和HXO Rb44细胞的形态特征及生长特性无明显差异。HXO Rb44/tk细胞仅占很低比例时即可观察到明显的旁观者效应 ,而GCV作用的HXO Rb44/tk细胞上清对HXO Rb44细胞无杀伤作用。结论 HSV tk基因转移联合GCV治疗可作为Rb基因治疗的一种有效方法 。 展开更多
关键词 HSV—tk/GCV 自杀基因系统 视网膜母细胞瘤 体外抗肿瘤效应 基因疗法 胸腺嘧啶核苷激酶
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自杀基因系统HSV-TK/GCV联合声动力疗法对人肺癌细胞NCI-446的体外杀伤实验 被引量:2
5
作者 李洋 马程远 +1 位作者 里程楠 钱东华 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期226-231,共6页
目的探讨自杀基因系统HSV-TK/GCV联合声动力疗法对人小细胞肺癌NCI-446细胞的体外杀伤作用。方法利用荧光和RT-PCR检测方法,筛选出含HSV-TK基因的阳性克隆株NCI-446/TK。用MTT法检测不同浓度的GCV对NCI-446/TK细胞的杀伤效应,以及不同... 目的探讨自杀基因系统HSV-TK/GCV联合声动力疗法对人小细胞肺癌NCI-446细胞的体外杀伤作用。方法利用荧光和RT-PCR检测方法,筛选出含HSV-TK基因的阳性克隆株NCI-446/TK。用MTT法检测不同浓度的GCV对NCI-446/TK细胞的杀伤效应,以及不同浓度混合NCI-446和NCI-446/TK细胞后的旁观者效应。同时,将HSV-TK/GCV自杀基因系统与声动力疗法进行联合,通过MTT法测定细胞存活率,并以流式细胞术检测细胞周期及凋亡率。结果当GCV浓度为0.2 mg/L时,筛选出的阳性克隆株NCI-446/TK细胞的生长受到明显的抑制(P<0.01),并且随着GCV浓度的递增,抑制效应越明显。当NCI-446/TK细胞占总细胞的10%时,有46%的混合培养细胞生长受到抑制(P<0.01),其抑制效应随NCI-446/TK细胞所占比例的增加而增加。将HSV-TK/GCV自杀基因系统与声动力疗法进行联合后,其细胞存活率明显低于单一治疗组(P<0.01),并且G0/G1期细胞所占比例及凋亡率均高于单一治疗组。结论 HSV-TK/GCV自杀基因系统的杀伤效应随着GCV浓度的递增而增强,并且有明显的旁观者效应。与声动力疗法联合后,其作用效果优于单一治疗组。 展开更多
关键词 自杀基因系统 声动力疗法 肺癌细胞 联合治疗
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消化系统癌肿的自杀基因疗法 被引量:8
6
作者 徐克成 吴建文 《世界华人消化杂志》 CAS 1999年第8期679-684,共6页
关键词 消化系统肿瘤 自杀基因 基因疗法
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自杀基因系统HSV1-TK/GCV对MEC-1细胞的体外杀伤及诱导凋亡作用 被引量:1
7
作者 司徒镇强 王江华 +3 位作者 刘斌 吴军正 李焰 贾永庆 《实用口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期458-461,共4页
目的 :探讨HSV TK/GCV系统对MEC 1细胞的体外作用。方法 :用脂质体介导将含有HSV 1 TK全长cDNA的真核表达质粒G1NATK转染人黏液表皮样癌细胞系MEC 1,经G418筛选 ,挑选阳性克隆 ,用PCR及RT PCR检测目的基因的整合及mRNA转录 ;分别用MTT... 目的 :探讨HSV TK/GCV系统对MEC 1细胞的体外作用。方法 :用脂质体介导将含有HSV 1 TK全长cDNA的真核表达质粒G1NATK转染人黏液表皮样癌细胞系MEC 1,经G418筛选 ,挑选阳性克隆 ,用PCR及RT PCR检测目的基因的整合及mRNA转录 ;分别用MTT及细胞记数法检测TK阳性细胞对GCV的体外敏感性及旁观者效应 ;用倒置显微镜、HE染色、活细胞荧光染色及TUNNEL染色观察GCV作用下MEC 1/TK的形态学变化。结果 :PCR及RT PCR分别从G418阳性克隆中成功扩增出 40 4bp的特异性基因片段 ,将此G418抗性克隆命名为MEC 1/TK ;IC50 MEC 1/TK为 0 .7μg/ml,而MEC 1为 10 0 0 μg/ml以上 ;当将TK阳性细胞和TK阴性细胞以不同比例混合 ,TK阳性细胞只占 10 %时 ,即有 90 %的细胞被杀死 ;形态学观察表明 ,经GCV作用 ,MEC 1/TK细胞变圆、脱壁、漂浮 ,部分细胞呈现核浓缩、核碎裂等特征 ,TUNNEL染色核阳性着色细胞明显增多。结论 :HSV TK/GCV系统在体外能明显杀伤MEC 1细胞 ,对GCV的敏感性比未转染的亲本细胞提高 10 0 0倍以上 ,并显示较强的旁观者效应 ;GCV可诱导部分MEC 展开更多
关键词 自杀基因系统 HSVl-TK/GCV系统 MEC-1细胞 唾液腺 肿瘤 自杀基因疗法
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HSV-tk/GCV自杀基因系统对喉癌细胞杀伤作用的体外研究 被引量:3
8
作者 刘志 成诗银 鱼兵 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期582-585,共4页
目的 研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法 构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外... 目的 研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法 构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。结果 Hep 2 /tk细胞与未转染tk基因的Hep 2 /0、Hep 2细胞相比较 ,三者的生长速度无明显差别。Hep 2 /tk细胞对GCV高度敏感 ,即低浓度GCV(0~ 1mg/L)处理Hep 2 /tk细胞 7d,可将其大部分细胞杀死 ,增加GCV的浓度 (>1mg/L)不能显著增强其对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。 结论 人喉癌细胞Hep 2对HSV tk/GCV系统高度敏感 。 展开更多
关键词 HSV-TK/GCV自杀基因系统 喉癌 细胞杀伤作用 体外研究 基因治疗 更昔洛韦
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HSV-TK/GCV自杀基因系统对人胰腺癌细胞的作用 被引量:1
9
作者 王静 鲁晓瑄 +2 位作者 张丽珊 陈道桢 李淑锋 《江苏医药》 CAS CSCD 北大核心 2004年第7期498-501,共4页
目的 运用自杀基因系统HSV TK/GCV治疗人胰腺癌细胞SW1990的实验研究 ,并证实旁观者效应。方法 通过脂质体介导的基因转移方法将含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (her pessimplexvirusthymidinekinasegene ,HSV TK)的复制缺陷型逆转录... 目的 运用自杀基因系统HSV TK/GCV治疗人胰腺癌细胞SW1990的实验研究 ,并证实旁观者效应。方法 通过脂质体介导的基因转移方法将含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (her pessimplexvirusthymidinekinasegene ,HSV TK)的复制缺陷型逆转录病毒载体GINaTK导入包装细胞PA317,然后利用细胞产生的假病毒颗粒感染人胰腺癌细胞系SW 1990细胞。在SW 1990 /TK细胞培养物中加入抗病毒前药GCV ,观察GCV对该细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果 实验表明GCV对SW1990 /TK有显著的抑制及杀灭作用 ,同时表现出强烈的旁观者效应。结论 HSV TK/GCV自杀基因系统对胰腺癌细胞有生长抑制及杀伤作用 。 展开更多
关键词 HSV-TK GCV 自杀基因 基因系统 胰腺癌 癌细胞 细胞培养
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靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用 被引量:3
10
作者 黄宗海 杨文宇 +2 位作者 龚小卫 钱勇 车小燕 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2004年第2期139-143,共5页
目的研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法... 目的研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdKDR-CDglyTK,重组质粒在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,以不同的感染复数(MOI)体外感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),利用重组病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因,荧光显微镜下观察重组腺病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),比较GCV(ganciclovir)和/或5-FC联合对转基因HUVEC细胞的杀伤作用。结果成功构建了AdKDR-CDglyTK重组病毒,并高效地转染了HUVEC,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高。被转染的HUVEC对GCV和5-FC高度敏感。另外,MOI一定时,细胞存活率随GCV和5-FC浓度增加递减;GCV和5-FC浓度一定时,细胞存活率随MOI升高而降低。不同前药组细胞存活率结果显示:联合应用GCV+5-FC较单用GCV或5-FC对感染细胞的杀伤作用更强(P<0.05)。结论KDR启动子-双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤效率与GCV和5-FC的浓度及重组腺病毒的MOI相关,联? 展开更多
关键词 靶向性双自杀基因系统 脐静脉内皮细胞 杀伤作用 血管内皮生长因子受体 基因治疗 KDR启动子 肿瘤
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HSV-TK+GFP/GCV自杀基因系统对小鼠胰腺癌的治疗作用 被引量:3
11
作者 刘为青 杨军 董坚 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2009年第15期1498-1503,共6页
目的:探讨HSV-TK+GFP/GCV自杀基因系统对小鼠胰腺癌细胞系MPC体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法:通过RT-PCR从基因组文库中扩增出HSV-TK基因全长CDS序列,并将其与GFP基因定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDN... 目的:探讨HSV-TK+GFP/GCV自杀基因系统对小鼠胰腺癌细胞系MPC体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法:通过RT-PCR从基因组文库中扩增出HSV-TK基因全长CDS序列,并将其与GFP基因定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1+/HSV-TK+GFP.脂质体法将重组质粒转染小鼠胰腺癌细胞株MPC细胞,得到带有HSV-TK和GFP基因的MPC/HSV-TK+GFP细胞,并将其分别用于体外和体内实验.结果:重组质粒pcDNA3.1+/HSV-TK+GFP导入小鼠胰腺癌细胞株MPC细胞.体外实验结果显示,当MPC/HSV-TK+GFP细胞数占混合细胞10%时,低浓度(20mg/L)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示GCV可明显抑制MPC/HSV-TK+GFP细胞在昆明小鼠体内的肿瘤形成.结论:HSV-TK和GFP基因转入小鼠胰腺癌细胞株MPC细胞并获得稳定表达,HSV-TK+GFP/GCV自杀基因系统在体内外对小鼠胰腺癌均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应. 展开更多
关键词 自杀基因治疗系统 旁观者效应 胰腺癌 小鼠
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HSV1-tk自杀基因系统对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应 被引量:1
12
作者 刘晶晶 杜标炎 +3 位作者 谭宇蕙 吴映雅 周瑶 刘喜娟 《广州中医药大学学报》 CAS 2010年第4期389-392,438,439,共6页
【目的】检测自杀基因系统单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1-tk/GCV)对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应。【方法】将B16/tk(tk+)细胞和未经修饰的B16(tk-)细胞按tk+细胞占总细胞数的0%、10%、20%、40%、80%比例分别进行混合,各组... 【目的】检测自杀基因系统单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1-tk/GCV)对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应。【方法】将B16/tk(tk+)细胞和未经修饰的B16(tk-)细胞按tk+细胞占总细胞数的0%、10%、20%、40%、80%比例分别进行混合,各组细胞于96孔板中培养,加入丙氧鸟苷(GCV)至15.7μmol/L,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同tk+细胞比例的HSV1-tk/GCV系统在体外对肿瘤细胞的杀伤率。各组混合细胞分别接种于小鼠腋下,以GCV注射液按100 mg.kg-1.d-1进行治疗,检测瘤体体积、湿质量,测定抑瘤效应。【结果】tk+比例10%以上治疗组,HSV1-tk/GCV系统对黑色素瘤B16细胞均有明显杀伤效应,但旁杀伤作用不明显;从移植瘤体积看,20%以上tk/GCV治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(P<0.05),以80%tk/GCV治疗组作用最显著(P<0.01);从移植瘤质量看,80%tk/GCV治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(P<0.01),其他组虽随着tk+细胞比例的增高瘤体平均质量下降,但差异无显著性意义。【结论】HSV1-tk/GCV系统对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应均随着B16/tk细胞比例的增高而增强,已建立显示出体外杀伤效应和体内抑瘤活性的小鼠黑色素瘤自杀基因系统。 展开更多
关键词 黑色素瘤 自杀基因系统/治疗应用 基因疗法 细胞培养
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CD/TK双自杀基因系统对Balb/c小鼠大肠癌的杀伤作用 被引量:1
13
作者 姚晓军 黄宗海 +1 位作者 李强 王朝阳 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2010年第7期1119-1122,共4页
目的:探讨腺病毒介导的以血管内皮生长因子(VEGF)启动的CD/TK双自杀基因对Balb/c小鼠大肠癌的杀伤作用。方法:将Ad-VEGF-CD/TK在293细胞中包装、扩增、纯化、鉴定,用CT26细胞通过皮下注射法建立荷大肠癌Balb/c小鼠模型,随机选取30只荷... 目的:探讨腺病毒介导的以血管内皮生长因子(VEGF)启动的CD/TK双自杀基因对Balb/c小鼠大肠癌的杀伤作用。方法:将Ad-VEGF-CD/TK在293细胞中包装、扩增、纯化、鉴定,用CT26细胞通过皮下注射法建立荷大肠癌Balb/c小鼠模型,随机选取30只荷瘤小鼠分为治疗组和对照组,每组15只小鼠。治疗组小鼠使用重组腺病毒和5-FC、GCV两种前药治疗,对照组注射生理盐水。记录两组小鼠不同时间点肿瘤生长体积,计算抑瘤率,3周后处死小鼠,取瘤,切片行TUNEL原位凋亡检测。结果:治疗组与对照组相比,治疗前肿瘤体积差异无统计学意义,第7、14、21天肿瘤体积差异有统计学意义(P<0.05),治疗组肿瘤体积较对照组明显变小,生长受抑制,第7、14、21天的抑瘤率分别为69.5%、75.1%、84.3%,TUNEL原位凋亡检测显示治疗组肿瘤细胞凋亡率较对照组明显增高,分别为(43.2±6.67)%和(2.4±0.91)%。结论:VEGF启动的CD/TK双自杀基因系统对Balb/c小鼠大肠癌具有明显的杀伤作用。 展开更多
关键词 肠肿瘤 自杀基因系统
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嘌呤核苷磷酸化酶/氟达拉滨(PNP/fludarabine)自杀基因系统对人肝癌细胞系BEL7402体外杀伤效应的研究 被引量:1
14
作者 李锋 王楚 +1 位作者 张萍 钱关祥 《胃肠病学》 2005年第1期3-9,共7页
背景:肿瘤细胞内表达的自杀基因可将无毒性的前药转化为高毒性代谢产物以杀伤肿瘤细胞,嘌呤核苷磷酸化酶/氟达拉滨(PNP/fludarabine)自杀基因系统具有目前已知最强的旁观者效应,成为基因治疗领域中的研究热点。目的:研究PNP/fludarabin... 背景:肿瘤细胞内表达的自杀基因可将无毒性的前药转化为高毒性代谢产物以杀伤肿瘤细胞,嘌呤核苷磷酸化酶/氟达拉滨(PNP/fludarabine)自杀基因系统具有目前已知最强的旁观者效应,成为基因治疗领域中的研究热点。目的:研究PNP/fludarabine自杀基因系统对人肝癌细胞系BEL7402的体外杀伤效应。方法:应用聚合酶链反应(PCR)从大肠杆菌K12菌株基因组DNA扩增PNP基因,通过8个甘氨酸的接头克隆至真核表达载体pEGFP鄄N1。将pEGFP鄄N鄄PNP以Lipofectamine2000转染BEL7402细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,命名为BEL7402/PNP。应用逆转录(RT)鄄PCR和RNA印迹法(Northernblotting)鉴定PNP基因的表达。分别应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和AnnexinV鄄FITC凋亡检测试剂盒检测PNP/fludarabine自杀基因系统对BEL7402细胞的细胞毒效应、旁观者效应和诱导凋亡作用。结果:RT鄄PCR和RNA印迹法证实转染的PNP基因能在BEL7402和BEL7402/PNP细胞中表达。低浓度fludarabine对经PNP基因转染的BEL7402细胞具有明显的细胞毒效应;旁观者效应检测显示,10%的BEL7402/PNP细胞与90%的BEL7402细胞混合,经低浓度fludarabine处理,90%的细胞可被杀死;细胞凋亡检测显示,PNP/fludarabine自杀基因系统对BEL7402细胞具有明显的诱导凋亡作用。结论:PNP/ 展开更多
关键词 嘌呤核苷磷酸化酶 氟达拉滨 自杀基因系统 肝癌细胞系 BEL7402 体外杀伤效应
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自杀基因系统杀伤作用机制研究进展 被引量:1
15
作者 杨淑英 段芳龄 《胃肠病学和肝病学杂志》 CAS 1998年第2期181-185,共5页
自杀基因杀伤作用机制的研究近年来倍受重视。目前杀伤作用机制概括起来有三种:直接杀伤转染有自杀基因的细胞;通过旁观者效应杀伤邻近细胞;(T细胞)免疫介导杀伤基因转染细胞邻近或远处的非转染细胞。本文对这三方面的具体作用机... 自杀基因杀伤作用机制的研究近年来倍受重视。目前杀伤作用机制概括起来有三种:直接杀伤转染有自杀基因的细胞;通过旁观者效应杀伤邻近细胞;(T细胞)免疫介导杀伤基因转染细胞邻近或远处的非转染细胞。本文对这三方面的具体作用机制及三者是否存在相互依赖。 展开更多
关键词 肿瘤 自杀基因系统 细胞凋亡 杀伤作用
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TK/GCV、CD/5-Fc双自杀基因系统治疗结肠癌的实验研究 被引量:1
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作者 魏冬 韦军民 +2 位作者 黄美雄 何庆泗 苏伟 《消化外科》 CSCD 2006年第6期466-470,共5页
目的观察胸苷激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-Fc)双自杀基因系统对结肠癌的治疗效果,并结合研究结果进行作用机理的分析。方法采用培养细胞移植法,将人结肠癌细胞系SW480接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠人结肠癌移... 目的观察胸苷激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-Fc)双自杀基因系统对结肠癌的治疗效果,并结合研究结果进行作用机理的分析。方法采用培养细胞移植法,将人结肠癌细胞系SW480接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型。将32只裸鼠随机分为4组:空白对照组,TK/GCV治疗组,CD/5-Fc治疗组,TK/GCV+CD/5-Fc联合治疗组,每组8只。TK/GCV+CD/5-Fc采用逆转录病毒介导,采用瘤体内直接注射法,同时腹腔注射GCV、5-Fc治疗,观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理、生存期等指标,比较观察各治疗组的治疗效果及对荷瘤裸鼠存活的影响。结果各治疗组裸鼠人结肠癌移植瘤的生长均受到显著抑制,治疗后各组体积数增加(P<0.05),治疗组裸鼠存活期显著延长,TK/GCV+CD/5-Fc联合治疗组效果最好,疗效q值=1.675>1.15,即TK/GCV、CD/5-Fc有交互协同作用。结论TK/GCV与CD/5-Fc对人结肠癌SW480细胞有明显抑制作用,TK/GCV、CD/5-Fc双自杀基因系统效果更强。 展开更多
关键词 结肠肿瘤 自杀基因系统 胸苷激酶 丙氧鸟苷 胞嘧啶脱氨酶 5-氟胞嘧啶 小鼠
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两种基于PNP/Mep-dR系统的新型融合自杀基因载体的构建及鉴定
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作者 蔡晓坤 林菊生 +2 位作者 刘址忠 周鹤俊 梁扩寰 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 北大核心 2005年第9期553-556,共4页
目的构建两个新型融合自杀基因表达载体并检测其表达。方法利用DNA重组技术制备两个融合基因PNPTK和PNPCD,将二者分别插入真核表达载体pcDNA3.0中,构建两个融合基因表达载体pcDNA3.0/PNPTK和pcDNA3.0/PNPCD;经酶切、PCR及测序鉴定各个... 目的构建两个新型融合自杀基因表达载体并检测其表达。方法利用DNA重组技术制备两个融合基因PNPTK和PNPCD,将二者分别插入真核表达载体pcDNA3.0中,构建两个融合基因表达载体pcDNA3.0/PNPTK和pcDNA3.0/PNPCD;经酶切、PCR及测序鉴定各个重组体。结果成功构建了两个新型融合基因表达载体并在肝癌细胞株HepG2中检测到二者的表达。结论两个基于PNP/MepdR系统的融合自杀基因表达载体是肿瘤基因治疗中杀瘤谱广、杀伤效应强大的理想载体。 展开更多
关键词 PNP/Mep-dR系统 融合自杀基因 肿瘤基因治疗
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自杀基因系统在前列腺癌基因治疗中的研究进展
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作者 曾浩 魏强 杨宇如 《华西医学》 CAS 2004年第4期681-683,共3页
关键词 前列腺癌 治疗中 自杀基因系统 基因 放射线治疗 恶性实体肿瘤 男性健康 人民 国家 威胁
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HSV1-TK自杀基因系统对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制效应
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作者 吴映雅 杜标炎 +2 位作者 谭宇蕙 赵鹏 王慧峰 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2005年第16期1959-1963,共5页
目的:构建表达单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组逆转录病毒,建立HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统并检测其对小鼠肝癌细胞H22移植瘤的抑制效应.方法:构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pLXSN-tk,用PolyFectTransfection试剂... 目的:构建表达单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组逆转录病毒,建立HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统并检测其对小鼠肝癌细胞H22移植瘤的抑制效应.方法:构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pLXSN-tk,用PolyFectTransfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将该重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞H22,以G418筛选的抗性克隆(命名为H22/tk);将H22/tk细胞与未经基因修饰的H22细胞按1:4混合接种小鼠皮下,联合应用GCV,观察其抑瘤作用(n=19).结果:经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1-tk基因成功定向插入到pLXSN逆转录病毒载体中;重组病毒DNA转染包装细胞PT67,获取病毒滴度为4×107cfu/L的重组逆转录病毒培养液;感染小鼠肝癌细胞H22后再筛选出G418抗性克隆株H22/tk.H22/tk细胞与H22细胞混合所致荷瘤鼠在GCV治疗前,各组间肿瘤体积无显著性差异;GCV治疗后,与对照组相比,GCV治疗组肿瘤的生长明显受到抑制,到第8,10,12,14d,致瘤模型对照组的肿瘤体积分别为356±205,635±382,963±580,1509±1105mm3,而GCV治疗组分别为231±155(VS对照组,t=-2.25,P=0.03),413±252(vs对照组,t=-2.14,P=0.04),592±420(vs对照组,t=-2.38,P=0.02),939±847mm3(vs对照组,t=-1.92,P=0.06),GCV治疗组的肿瘤生长抑制率分别为35.0%,35.0%,38.5%,37.8%.结论:成功获取表达HSV1-tk基因的逆转录病毒,已建立显示出体内抑瘤活性的自杀基因治疗系统,为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础. 展开更多
关键词 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 自杀基因系统 肝癌 小鼠肝癌细胞H22 抑制效应 HSV1-TK HSV1-TK/GCV 重组逆转录病毒感染 细胞移植瘤 HSV1-tk基因
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特异性启动子LEP503介导的自杀基因系统对晶状体上皮细胞增殖的抑制作用
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作者 杨晋 卢奕 +1 位作者 刘天津 蒋永祥 《眼科新进展》 CAS 北大核心 2011年第10期912-916,共5页
目的构建晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)特异性启动子LEP503(lens epithelium gene product503)调控的Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP载体,观察慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙环鸟苷系统(herps simplex virus thymidine ki... 目的构建晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)特异性启动子LEP503(lens epithelium gene product503)调控的Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP载体,观察慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙环鸟苷系统(herps simplex virus thymidine kinase/ganciclov-ir,HSV-tk/GCV)自杀基因系统对人晶状体上皮细胞(HLEC)增殖的靶向性抑制作用。方法用RT-PCR方法从HLEC基因组中克隆LEP503启动子序列,构建单纯LEP503启动子调控HSV-tk基因表达的慢病毒载体Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP,同时构建广谱启动子巨细胞病毒(cytomegalo virus,CMV)调控的HSV-tk载体Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP。将特异性表达载体Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP分别转入HLEC和Hela细胞,用荧光显微镜观察荧光强度,用RT-PCR方法评估相关蛋白的组织特异性表达。将Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP和Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP分别转入HLEC,通过荧光显微镜观察EGFP的表达,用流式细胞仪及RT-PCR比较CMV与LEP503启动子介导下游靶基因HSV-tk的表达差异。结果 Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP能在HLEC中特异性表达,但Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP的表达效率明显低于Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP。转染Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP的HLEC在20mg·L-1GCV作用48h后EGFP阳性细胞的形态发生明显变化;GCV作用24h后Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP转染HLEC较正常HLEC和Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP转染Hela细胞活性有明显抑制,且随时间的延长抑制效果逐渐增强。结论 LEP503启动子能介导HSV-tk基因在HLEC中特异表达,并介导HSV-tk/GCV自杀基因系统靶向性抑制HLEC增殖,但该启动子表达效率较低,所介导的HSV-tk/GCV系统对HLECs增殖的抑制效率低于CMV启动子。 展开更多
关键词 慢病毒 单纯疱疹病毒酶 胸苷激酶 晶状体上皮细胞 特异性启动子 LEP503 自杀基因系统
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