铁皮石斛DcNAC1基因克隆、表达及转录自激活活性分析

【目的】克隆铁皮石斛NAC转录因子基因(DcNAC1),并进行表达模式及转录自激活活性分析,为铁皮石斛抗逆相关基因鉴定及其分子机制研究提供参考。【方法】以铁皮石斛cDNA为模板,PCR扩增DcNAC1基因,运用生物信息学软件分析DcNAC1蛋白的理化性质、保守结构域、信号肽、跨膜结构域及亚细胞定位,通过实时荧光定量PCR检测DcNAC1基因在不同组织和不同逆境胁迫下的表达模式。同时构建该基因的酵母表达载体,分析其转录自激活活性。【结果】从铁皮石斛中PCR扩增获得DcNAC1基因的开放阅读框(ORF),全长为945 bp,与参考序列(LOC110104882)的核苷酸序列相似性为100%。该基因编码314个氨基酸残基,蛋白分子量为35.40 kD,理论等电点(pI)为8.16,为不稳定的亲水性蛋白,定位于细胞核,不含信号肽和跨膜结构域,含有特征性的NAC保守结构域。DcNAC1基因的启动子序列含茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、胁迫响应元件(TC-rich repeats)、光响应元件(G-box)、干旱诱导MYB结合位点(MBS)和低温响应元件(LTR)。根中DcNAC1基因的相对表达量在高温胁迫和低温胁迫处理6 h分别达最高,显著高于处理0 h(P<0.05,下同);茎中DcNAC1基因在盐胁迫处理48 h的相对表达量达最高,显著高于处理0 h。将构建的重组质粒pGBKT7-DcNAC1转化酵母菌株Y2HGold,结果发现该重组质粒无毒性,DcNAC1蛋白具有自激活活性。【结论】DcNAC1基因表达受到茉莉酸、低温、干旱、光信号和逆境胁迫等多种信号的调控。DcNAC1蛋白具有自激活活性,通过激活下游基因的表达,参与到植物生长发育和逆境胁迫响应的转录调控过程中。

丹参3个R2R3-MYB转录因子的亚细胞定位和自激活活性分析

R2R3-MYB转录因子能够有效调控丹参酚酸类物质的积累。将丹参的SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93与拟南芥的R2R3-MYB进行比对,找到拟南芥中与丹参3个转录因子亲缘关系最近的功能已知的转录因子,根据这些功能已知的转录因子,对丹参3个转录因子的功能进行预测。构建含有绿色荧光报告基因的载体pA7-GFP-SmMYB33、pA7-GFP-SmMYB54和pA7-GFP-SmMYB93,使用基因枪方法将载体分别转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析,结果表明3个转录因子主要定位在细胞核,绿色荧光也有少部分出现在细胞质中。构建酵母表达载体pDEST-GBKT7-SmMYB33、pDEST-GBKT7-SmMYB54和pDESTGBKT7-SmMYB93用于酵母自激活活性分析,结果表明SmMYB33有自激活活性,SmMYB54和SmMYB93没有自激活活性。

弓形虫ROP2酵母双杂交诱饵表达载体构建及毒性和自激活活性检测

目的为筛选弓形虫分泌毒性因子-棒状体蛋白2（ROP2）在终末宿主细胞内的互作因子,构建ROP2的酵母双杂交诱饵表达载体,并检测其表达蛋白对酵母菌生长的毒性作用及自激活活性。方法根据ROP2蛋白的特性选取1-561氨基酸、25-241氨基酸、242-561氨基酸作为目的片段,PCR扩增弓形虫基因组获得3片段,定向克隆到酵母表达载体pGBKT 7上,经测序正确后,将其转化到酵母菌Y187感受态细胞,在缺陷性培养基上观察3个诱饵表达载体在Y187中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能。结果成功扩增出ROP2基因的3个目的片段,并将其克隆到诱饵表达载体pGBKT7中,经测序及酶切鉴定结果正确,转化到酵母Y187细胞中的诱饵表达载体无毒性和自激活作用。结论成功获得了对宿主酵母细胞无毒性且未自主激活活性的诱饵表达载体pG-BKT7-ROP2 1-561、pGBKT7-ROP2 242-561、pGBKT7-ROP2 25-241,可作为酵母双杂合系统中的＂诱饵＂,为下一步利用酵母双杂交系统筛选ROP2在终末宿主细胞内的相互作用蛋白创造了条件。

紫花苜蓿MsMYB33基因克隆、亚细胞定位及转录自激活检测

MYB(V-myb Avian myeloblastosis viral Oncogene Homolog)转录因子数量较多、功能多样,在植物的发育过程中起着十分重要的作用。为了探究紫花苜蓿(Medicago sativa)中MsMYB33基因的亚细胞定位及自激活特性,本研究从紫花苜蓿中克隆MsMYB33基因,该基因开放阅读框为1641 bp,编码多肽含有546个氨基酸。遗传进化树显示MsMYB33蛋白与鹰嘴豆(Cicer arietinum)中的CaMYB33蛋白同源关系最高。将MsMYB33与黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein,YFP)进行融合表达,结果显示:MsMYB33蛋白定位于细胞核。通过DNA重组技术成功构建pGBKT7-MYB33酵母表达载体,并转化到Y2HGold酵母菌中。酵母自激活检测结果显示,MsMYB33具有自激活活性,进一步分析发现激活区域位于C端。本研究为进一步研究紫花苜蓿MsMYB33基因及MYB转录因子家族提供了科学依据。

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)MtAP2转录因子的克隆及自激活检测

AP2转录因子在植物生长发育过程中具有重要作用,为深入研究蒺藜苜蓿MtAP2转录因子的功能,于蒺藜苜蓿中克隆MtAP2转录因子,进行生物信息学分析,构建诱饵表达载体PGBKT7-MtAP2并转入酵母菌中,进行自激活活性检测。结果显示,本研究成功克隆了蒺藜苜蓿MtAP2转录因子,其开放阅读框为624 bp,编码207个氨基酸。生物信息学分析显示,蒺藜苜蓿MtAP2蛋白与鹰嘴豆的亲缘关系最为接近。诱饵表达载体PGBKT7-AP2构建成功,转入到Y2H酵母菌中,且通过在营养缺陷型培养基培养证明其没有自激活活性。本研究成功克隆了蒺藜苜蓿MtAP2转录因子,构建了酵母诱饵表达载体PGBKT7-MtAP2,并证明其不存在自激活现象,后续可进行互作蛋白筛选。

酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质

目的:利用酵母双杂交系统从人心肌cDNA文库中筛选与热激蛋白70(HSP70)相互作用的蛋白质。方法:从人心脏cDNA文库扩增Hsp70基因,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-Hsp70酵母细胞AH109中的自激活活性;将构建的酵母表达诱饵质粒载体pGBKT7-Hsp70转化AH109酵母细胞,与转化有人心脏cDNA文库的酵母Yl87进行交配实验,筛选与HSP70相互作用的蛋白质,通过一对一的回复杂交实验排除假阳性,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:构建了"诱饵"质粒栽体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活活性,筛选得到多个与Hsp70相互作用的阳性转化子,并最终得到HSP70的1个相互作用蛋白质HIP。结论:应用酵母双杂交系统筛选出与HSP70相互作用的1个蛋白质,它们的相互作用可能与HSP70发挥细胞分子伴侣作用有关。

C35基因诱饵表达载体的构建及活性检测

目的C35是一种新型的乳腺癌肿瘤标志基因,在乳腺癌细胞中存在普遍性高表达,可作为乳腺癌早期诊断的标志分子。为了进一步揭示C35基因在乳腺癌的发生和发展中对癌细胞的调控和信号转导机制,本研究拟构建C35基因的酵母双杂交诱饵表达载体,并进行自激活活性和诱饵蛋白毒性检测。方法采用RT-PCR自乳腺癌T47D细胞中克隆C35表达序列,合成3种C35基因片段,连接入诱饵表达载体pGBKT7,采用选择性培养皿和β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)分析检测重组质粒的自激活活性和细胞毒性。结果3种诱饵表达载体经鉴定全部克隆成功,其中C35全长基因的表达产物对酵母细胞具有生长抑制作用,两种截短体C35 1-153和C35 154-348不具有自激活活性和细胞毒性,无需3-AT抑制。结论C35全长基因的诱饵表达载体可能具有抑制酵母细胞自身蛋白表达系统的作用,两种截短体重组载体可应用于乳腺癌T47D cDNA文库双杂交筛选。

海岛棉GbWRKY32基因的克隆及特性分析

利用RT-PCR技术从海岛棉品种新海21中克隆了1个WRKY基因,在GenBank数据库中比对发现其与陆地棉GhWRKY32的序列高度同源,因此命名为GbWRKY32。该基因ORF为1 077 bp,编码358氨基酸,预测分子量为39.288 k D,等电点为5.02。序列分析表明该基因含有一个WRKY保守结构域,锌指结构为:C-X5-C-X23-H-X1-H,属于WRKY转录因子家族Ⅱ类D组成员。GbWRKY32蛋白为疏水性蛋白,不具有跨膜区和信号肽结构。GbWRKY32转录因子不具有转录自激活活性。本研究成功构建GbWRKY32基因的植物表达载体并转入根癌农杆菌EHA105菌株中,这有助于该基因功能的后续研究。

绵羊FHL2基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了利用绵羊卵巢酵母双杂交cDNA文库筛选与FHL2蛋白相互作用的宿主蛋白,构建重组诱饵载体pGBKT7-FHL2,试验从绵羊卵巢组织中提取总RNA并反转录为cDNA,依据FHL2基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增FHL2目的片段,连接到经限制性内切酶EocRⅠ和BamHⅠ酶切后的酵母空载体pGBKT7上,并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,进行PCR鉴定及测序比对分析,将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-FHL2转化到酵母Y2HGlod感受态细胞中,利用酵母双杂交系统检测其表达情况、自激活活性及细胞毒性。结果表明:PCR扩增出大小约为876 bp的目的条带;成功构建出重组诱饵载体pGBKT7-FHL2,测序结果与NCBI中预测的FHL2碱基序列同源性为100%;重组诱饵载体pGBKT7-FHL2可在酵母Y2HGold感受态细胞中表达FHL2蛋白,对酵母Y2HGold感受态细胞无自激活活性和毒性作用。说明试验成功构建出重组诱饵载体pGBKT7-FHL2,通过检测证明该重组诱饵载体能够用于酵母双杂交系统筛选互作蛋白。