阻断KIR2DL4(CD158d)增强NK细胞的杀伤功能

目的利用抗体阻断人原代培养的自然杀伤(NK)细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(KIR2DL4),抑制其与配体人白细胞抗原G(HLA-G)的结合,观察对NK细胞杀伤功能的影响。方法用免疫磁珠法分离人NK细胞并培养,流式细胞术检测所得NK细胞的纯度;流式细胞术检测NK细胞表面KIR2DL4的表达水平和人乳腺癌SK-BR-3细胞表面HLA-G的表达水平;将NK细胞与SK-BR-3细胞共培养,并加入KIR2DL4的阻断抗体,ELISA检测NK细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)的水平,利用流式细胞术检测NK细胞表面CD107a的表达水平,以检测其脱颗粒情况。结果分离得到的人原代NK细胞纯度可达90%以上;共培养实验发现,KIR2DL4的阻断抗体可促进NK细胞分泌IFN-γ,且NK细胞表面CD107a的表达水平也明显提高,提示其脱颗粒能力增强。结论阻断KIR2DL4信号可明显促进NK细胞的杀伤功能,KIR2DL4在NK细胞杀伤靶细胞的过程中发挥抑制性作用。

中国北方汉族人群KIR2DL4等位基因水平多态性的研究

目的了解中国北方汉族人群KIR2DL4等位基因水平的分子遗传多态性。方法采用磁珠法从327人份北方汉族无关个体标本中提取基因组DNA,采用本实验室建立的KIR2DL4测序分型专利技术对KIR2DL4基因的全部编码区(CDS)序列分为4段做特异性PCR扩增后,采用Sanger测序法对扩增产物所涵盖的每个外显子做双向测序。所获得的序列用Assign 4.7分析软件分析每个标本的基因型。结果共检出8种KIR2DL4等位基因,基因频率由高到低分别为KIR2DL4^(+)00102[77.1%(252/327)]、^(+)00501[35.8%(117/327)]、^(+)011[20.2%(66/327)]、^(+)00602[12.5%(41/327)]、^(+)00801[8.6%(28/327)]、^(+)00103[4.9%(16/327)]、^(+)00503[1.5%(5/327)]、^(+)00504[0.9%(3/327)]。能正常膜表达的10A型等位基因(KIR2DL4^(+)00102、^(+)00103、^(+)00501、^(+)00503、^(+)00504、^(+)00602)及存在CDS nt811位置腺嘌呤缺失而不能正常膜表达的9A型等位基因(KIR2DL4^(+)00801、^(+)011)的检出比例分别为97.6%(319/327)及27.8%(91/327),约为3.5∶1。与南方汉族人群相比较,中国北方汉族人群KIR2DL4各等位基因的检出频率无明显差异(P>0.05)。结论所获得的KIR2DL4分子遗传多态性数据可为疾病关联、人类进化等研究提供重要参考。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体在子痫前期胎盘组织中的表达及意义

子痫前期是妊娠期特有的疾病，其病因及发病机制不清，大多数学者认为可能与某些遗传因素引发的免疫功能失调，造成滋养细胞侵润障碍，导致胎盘浅着床有关[1]。杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR2DL4）通过识别滋养细胞表面的人类白细胞抗原G（HLA-G），向自然杀伤（NK）细胞传递抑制性信号，抑制NK细胞对胎儿成分的杀伤作用，其表达异常可能使胎儿和母体之间的免疫平衡失调，引发病理性妊娠[2]。本研究对KIR2DL4基因在胎盘的表达情况进行研究，探讨KIR基因在子痫前期发病中的可能作用，报告如下。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DS4及其变体KIR1D与梅毒的关联性研究

目的探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunogloblin-like receptor，KIR）基因KIR2DS4及其变体KIR1D与属于KIR基因单体型A（haplotypeA）的梅毒（syphilis）患者的关联性。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）法，分析192例无血缘关系的健康人和190例梅毒患者KIR基因的单体型，在归类于单体型A的梅毒患者和健康人群中分析KIR2DS4和KIR1D基因与梅毒的关联。结果在192例健康者中，含有KIR2DS4基因的个体为187例，其中有91例归类于纯合子（homozygous）单体型A，占48．7％（91／187）；在190例梅毒患者中，出现KIR2DS4基因的个体为181例，其中有89例归类于纯合子单体型A，占49．2％（89／181）。在归属于单体型A的人群中，KIR1D／KIRlD在梅毒病例组的基因型频率为16．9％，显著高于对照组（6．6％，P=0．032），而KIR2DS4／KIR2DS4和KIR2DS4／KIR1D基因型频率在两组间差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论KIR1D／KIR1D可能与纯合子单体型A中的个体的梅毒发生相关联。

KIR2DS4等位基因在无关全相合异基因造血干细胞移植中的作用

目的 研究中国南方汉族人群中KIR2DS4等位基因分布及2DS4基因对无关供者全相合造血干细胞移植（HSCT）的影响.方法 采用基因测序（Sequenee-based testing,SBT）和TOPO-TA 克隆相结合的方法 ,对接受HSCT的75对HLA-A、-B、-Cw、-DRB1、-DQB1高分辨全相合的供、受者进行KIR2DS4等位基因分型,150名供、受者均为中国南方汉族人群,75例受者中急性淋巴细胞白血病（ALL）29例,慢性粒细胞白血病（CML）24例,急性髓系白血病（AML）19例,其他恶性血液病3例.结果 150名供、受者中139例（92.7%）存在KIR2DS4基因,对2DS4基因全长测序后发现4个2DS4等位基因：KIR2DS4＊00101、＊003、＊004和＊007;109例（78.4%）存在2DS4＊00101;2DS4缺失型（具有1个或缺失2DS4＊00101基因）与完整型（具有两个2DS4＊00101基因）的存在比率为1：2;发现3个KIR2DS4新基因.当供者KIR分型为B/x（40例）时,移植后总体生存率明显高于供者为A/A组（35例）[RR=3.1（95%CI 1.1～8.6）,P=0.007];当供者为完整型（36例）时,移植后总体生存率低于供者为缺失型（39例）（P=0.031）;在A/A组中,当供者为完整型（14例）时,移植后急性移植物抗宿主病（GVHD）的发生率明显高于供者为缺失型（21例）[RR=9.0（95%CI 1.2～66.9）,P=0.010],并以Ⅲ～Ⅳ度aGVHD尤为明显（P=0.006）.结论 SBT与TOPO-TA基因克隆的高分辨分型方法可用于研究KIR基因家族多态性,并且移植前在HLA分型的基础上对供受者进行KIR2DS4基因分型,可能对临床选择合适的供者提供有利的依据.

KIR2DS4基因分型方法建立及新等位基因KIR2DS4^(*)016的鉴定

目的建立稳定的KIR2DS4基因测序分型法并研究KIR2DS4在中国汉族人群中等位基因多态性。方法采用PCR序列特异性引物(sequence specific primer,SSP)分析法对222名随机中国汉族个体基因组中的KIR2DS4基因进行阴阳性初筛鉴定,对KIR2DS4阳性的标本采用高保真、长片段PCR测序分型技术(PCR-sequence based typing,PCR,PCR-SBT)对KIR2DS4基因的第4、5外显子的片段进行扩增、测序及分型。结果建立的PCR-SBT方法成功扩增出KIR2DS4基因的第4、5外显子序列,长度达3.2 kb。探究中国汉族人群中KIR2DS4等位基因型及频率。检出KIR2DS4阳性个体为209个,阳性率为94.1%。测序分型共发现12种基因型和7种等位基因,6种已知的等位基因及其检出频率为:KIR2DS4^(*)00101/011(180次,81.1%),KIR2DS4^(*)010(53次,23.9%),KIR2DS4^(*)004(34次,15.3%),KIR2DS4^(*)003(15次和6.8%),KIR2DS4^(*)006(2次,0.9%)以及KIR2DS4^(*)015(1次,0.5%)。发现并鉴定一个新等位基因KIR2DS4^(*)016,与其最相近的等位基因KIR2DS4^(*)010区别在第5外显子,KIR2DS4^(*)010的第5外显子是22 bp缺失型,而KIR2DS4^(*)016的第5外显子为完整型。该新等位基因在受检人群中被发现3次,频率为1.4%,并非罕见等位基因,该等位基因序列已向GenBank(登录号:KC414890)及IPD-KIR数据库(提交号:IWS40001804)提交,并获得世界卫生组织HLA系统命名因子委员会的命名。结论本文中我们成功建立了KIR2DS4基因4、5外显子测序分型方法,并对其等位基因多态性进行了探究,发现了新的KIR2DS4等位基因型,丰富了中国汉族人群KIR2DS4基因多态性数据。

中国汉族人群KIR2DL1高分辨等位基因分布频率及识别HLA—C配体的特点

目的研究中国汉族人群KIR2DL1高分辨等位基因频率及识别HLA-C配体的分布特点。方法采用基因测序和序列特异性引物聚合酶链反应（PCR—SSP）方法，对中华骨髓库登记的111例患者和116名无关供者，共计227份样本进行KIR2DL1高分辨等位基因分型和KIR基因分型，有105例患者接受异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）。结果227份样本中有224份（98．68％）样本存在KIR2DL1基因，在448个等位基因中共发现3种KIR2DL1＊00302、＊00201、＊00401等位基因多态性，基因表型频率分别为84．82％（380／448）、12．05％（54／448）和3．13％（14／448），等位基因频率分别为61．04％、6．22％、1．58％，并与欧美人种基因频率分布差异有统计学意义。在6种KIR2DL1高分辨等位基因组合中KIR2DL1＊00302、00302（74．55％）纯合组合为最常见的基因型，且KIR2DL1＊00302、00401组合频率在A／A和B／x中的分布差异有统计学意义（P=0．001），含KIR2DLI＊00401的等位基因组合在A／A中无基因频率分布。KIR2DL1＊00302和KIR2DL1＊00201分别均与KIR2DS1、KIR2DL3、KIR2DS4和KIR3DL1／S1有连锁关系（P〈0．001）。在allo—HSCT的KIR／HLA受配体模式中KIR2DL1＊00302与HLA—C2组位点存在相关性，且与HLA—C＊06：02是最常见的识别受配体组合，而与HLA-C＊01：02受配体模式是最常见的产生异源反应活性的组合，二者在受配体模式中的分布差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论KIR2DLI＊00302是中国汉族人群中最常见的等位基因，KIR2DLl高分辨基因分型可预测移植后供者NK细胞的异源反应活性并有利于供者的筛选。