牙鲆自然杀伤细胞增强因子（NKEF）全长cDNA的克隆及表达分析

采用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)的方法,分离和测定了牙鲆自然杀伤细胞增强因子(NKEF)cDNA的全长核苷酸序列,5'RACE扩增分离得到了400bp左右的片段,3'RACE扩增得到了800bp左右的片段,经过拼接得到了牙鲆NKEF全长cDNA序列.牙鲆NKEF cDNA全长1028bp(不包含polyA),其中包括67bp的5'非翻译区、597bp的开放阅读框和364bp的3'非翻译区(不包含polyA),整个开放阅读框编码198个氨基酸.RT-PCR分析表明,NKEF基因在牙鲆不同组织中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异.研究结果为提高牙鲆自身免疫防御能力的研究提供了理论依据.

自然杀伤细胞2组成员A、程序性死亡因子配体1表达检测对PD-L1阻断免疫治疗肌层浸润性膀胱癌反应性的预测价值

目的:探究自然杀伤细胞2组成员A(NKG2A)及程序性死亡因子配体1(PD-L1)表达检测对PD-L1阻断免疫治疗肌层浸润性膀胱癌反应性的预测价值。方法:选取100例肌层浸润性膀胱癌患者作为研究对象,对其行PD-L1阻断免疫治疗后,根据治疗反应性将其分为缓解组和未缓解组;对缓解组患者随访3个月,将其分为复发组和未复发组。比较两组患者NKG2A和PD-L1在CD4^(+)和CD8^(+)上的表达水平,采用ROC曲线分析NKG2A和PD-L1预测膀胱癌患者治疗反应性的价值。结果:100例研究对象中,缓解组患者72例(72.00%),未缓解组患者28例(28.00%),两组性别、年龄比较无统计学差异(均P>0.05),但缓解组患者肿瘤直径小于未缓解组,NKG2A、PD-L1/CD4^(+)和PD-L1/CD8^(+)表达水平均低于未缓解组(均P<0.05)。膀胱癌患者NKG2A、PD-L1/CD4^(+)和PD-L1/CD8^(+)表达预测免疫治疗后缓解的AUC值分别为0.771、0.724、0.710;联合诊断的AUC为0.836。72例缓解患者中,出现复发29例(40.28%),未出现复发43例(59.72%),两组性别、年龄以及肿瘤直径比较无统计学差异(均P>0.05),但复发组NKG2A、PD-L1/CD4^(+)和PD-L1/CD8^(+)表达水平均高于未复发组(均P<0.05)。NKG2A、PD-L1/CD4^(+)和PD-L1/CD8^(+)表达预测膀胱癌患者缓解后复发的AUC值分别为0.775、0.740、0.728;联合诊断的AUC为0.874。结论:NKG2A、PD-L1/CD4^(+)和PD-L1/CD8^(+)在不同治疗反应性肌层浸润性膀胱癌患者外周血中表达水平不同,三者对于膀胱癌患者PD-L1阻断免疫治疗反应性均有一定的预测价值,且三者联合预测效能最佳。

自然杀伤细胞增强因子研究进展

自然杀伤细胞增强因子(natural killer enhancing factor,NKEF)是在进化上高度保守的一类蛋白质,与其它调节NK细胞的免疫分子均未显示出明显的序列相似性。该蛋白质家族具有两个特征结构域,分别位于氨基酸序列的N端和C端,两个结构域中均包含有氧化还原活性的Cys。NKEF是一种多功能蛋白质,参与机体抗氧化调节,具有抗感染、抗HIV-1病毒活性,参与细胞增殖、分化及凋亡,在红细胞免疫中发挥重要作用。本文对NKEF的分子特点、生物学活性及其研究现状进行了综述。

最优化细胞因子诱导杀伤细胞／自然杀伤细胞少因子培养体系的探索

【目的】尝试使用IL-2、IL-7和IL-12的单因子、双因子和三因子组合进行杀伤细胞/自然杀伤细胞(CIK/NK)细胞扩增培养,探讨最优化CIK/NK细胞少因子培养体系的建立。【方法】采用Ficoll-Hypaque法分离脐血单个核细胞并分成6组,每组分别加入IL-2(80ng/mL)、IL-7(40ng/mL)及IL-12(40ng/mL)的单因子、双因子和三因子组合(IL-7组;IL-12组;IL-7+IL-12组;IL-2+IL-7组;IL-2+IL-12组;IL-2+IL-7+IL-12组),每组6个重复孔,共培养21d收获细胞。在细胞培养开始和第21天,实验各组取细胞悬液进行流式细胞仪检测CD3+CD56+CIK细胞及CD3-CD56+NK细胞比例。【结果】单因子培养体系的IL-12组在CIK细胞扩增比例上是各组中最高的(22.96±1.41)%,双因子体系的IL-2+IL-12组的CIK细胞扩增比例也达到(18.58±0.68)%;上述两组的CIK细胞扩增比例已经达到或基本达到使用传统多因子扩增方法所获得的比例。IL-12组的NK细胞扩增比例为(30.23±1.18)%,IL-2+IL-7组的NK细胞扩增比例也达(29.52±0.89)%。【结论】使用IL-12、IL-2+IL-12或IL-2+IL-7组合的少因子培养体系进行CIK/NK细胞的培养扩增是可行的。

细胞因子诱导杀伤细胞/自然杀伤细胞培养过程中CD16及CD11a的表达变化

背景:由于细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞上表达的CD16和CD11a均与其介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用和直接接触杀伤的抗肿瘤效应密切相关,因此了解两种细胞扩增过程中这两种分子表达的强弱,对根据免疫效应细胞的最终用途决定两种细胞的最佳收获时机具有重要意义。目的:了解细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞在培养过程中的CD16和CD11a表达的变化规律。设计、时间及地点:细胞移植免疫学动态观察,于2006-09/2008-03在中山大学附属第二医院完成。材料:脐血来自本院健康足月妊娠产妇。方法:采用Ficoll-Hypaque法分离脐血单个核细胞,接种于含体积分数为0.15胎牛血清的IMDM,双抗生素青、链霉素各1×105U/L24孔培养板中,在培养体系中加入白细胞介素2、白细胞介素7、白细胞介素15、干细胞因子及FLT3L制备细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞,每隔3天半量换液及全量补充上述细胞因子。主要观察指标:流式细胞仪检测CD3+CD56+细胞因子诱导杀伤细胞以及CD3-CD56+自然杀伤细胞在4周培养过程中CD16和CD11a表达的变化。结果:CD16在细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞上的表达随着培养时间的延长逐渐增加,在两类细胞上均在培养的第4周达到最高峰,分别为(55.99±3.90)%和(7.86±1.66)%,但CD16在自然杀伤细胞上表达比例较低,整个培养过程中自然杀伤细胞上CD16的均数表达没有超过8%。CD11a在细胞因子诱导杀伤细胞培养的第3周,自然杀伤细胞培养的第2周达到最高峰,分别为(49.32±6.32)%和(82.31±11.33)%,之后逐渐出现下降,到培养第4周几乎消失。结论:CD16和CD11a在细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞上的表达随培养时间呈动态变化,使用单克隆抗体联合细胞因子诱导杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用效应时,细胞的收获期可在细胞培养的第4周,利用细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞的直接杀伤效应进行细胞过继免疫,那么收获细胞的时间以细胞培养的第3周为宜。

外源性细胞因子对早孕蜕膜调节自然杀伤细胞活性的作用

为探索外源性细胞因子对妊娠的影响，本研究在培养的蜕膜细胞中加入不同浓度的干扰素γ、表皮生长因子、白细胞介素２ 和白细胞介素６，培养 １２、２４ 和 ４８ 小时后取其上清液，５ １ Ｃｒ 掺入法检测其对人外周血自然杀伤细胞（ Ｎ Ｋ）的杀伤作用。结果发现，该上清液可以促进人外周血 Ｎ Ｋ 细胞的杀伤活性，这种作用与细胞因子的种类、浓度及作用时间无明显相关性。提示外源性细胞因子有可能通过破坏蜕膜细胞因子网络平衡状态对妊娠造成危害。

术后硬膜外镇痛对肺癌根治术患者血浆炎性细胞因子和自然杀伤细胞的影响

目的评价术后硬膜外镇痛对肺癌根治术患者血浆炎性细胞因子和自然杀伤(NK)细胞的影响。方法择期行肺癌根治术患者30例,术后按镇痛方法不同均分为硬膜外自控镇痛(PCEA)组(E组)和静脉自控镇痛(PCIA)组(I组)。E组硬膜外输注含0.125%布比卡因、芬太尼2.4μg/ml和咪唑安定0.05mg/ml的混合液;I组静脉输注含芬太尼20μg/ml、咪唑安定0.1mg/ml和托烷司琼0.04mg/ml混合液。分别于麻醉前(T1)、术后2h(T2)、术后1d(T3)、3d(T4)、5d(T5)、7d(T6)抽取外周静脉血,检测干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-5、IL-10和NK细胞及血常规。采用VAS评估镇痛效果,用Ramsay方法评估镇静程度。结果两组VAS评分、恶心呕吐及术后感染的发生率差异无统计学意义;与I组相比,E组Ramsay镇静评分、TNF-α和IL-5降低(P<0.05),IL-2、IFN-γ和NK细胞活性升高(P<0.05)。结论与PCIA相比,PCEA能抑制促炎性细胞因子的释放,改善NK细胞的活性。

人外周血细胞因子诱导的自然杀伤细胞的体外高效扩增

使用干细胞生长培养基 (SCGM )和RPMI16 4 0培养基 ,设计不同浓度的抗CD3单抗、IL 2和PHA的培养条件 ,从健康成人外周血单个核细胞 (PBMC )中高效扩增细胞因子诱导的自然杀伤细胞 (CINK ) ,并用MTT法检测其细胞毒活性 ,优化CINK细胞的体外扩增技术。用优化的方法扩增 12例不同类型恶性肿瘤患者CINK细胞。结果显示 ,在以SCGM为基础培养基时 ,PBMC经抗CD3单抗、IL 2作用后获得大量增殖 ,在PHA存在时获得最大增殖 (P <0 0 5 ) ,扩增的CINK细胞以CD3 CD5 6 + NK细胞为主 ,扩增细胞的细胞毒活性显著高于相同来源的CIK细胞和CD3AK细胞 。

肺结核患者外周血自然杀伤细胞和T细胞数量和细胞因子水平变化

抗结核免疫低下是结核易感及发展为活动性病变的主要因素。小儿和老人是结核病的好发人群，可能是因为小儿免疫系统不成熟而老人免疫功能渐渐衰退所致。机体对抗外来病原体的入侵首先是依赖先天免疫做出快速而强烈的反应，随后才是具有抗原特异性的获得性免疫反应。在结核病状态下，

子宫内膜异位症患者腹腔液中自然杀伤细胞活性及细胞因子测定

目的 了解子宫内膜异位症 (内异症 )患者腹腔液中自然杀伤细胞 (NK细胞 )活性以及白细胞介素 -6(IL-6)、白细胞介素 -8(IL -8)、肿瘤坏死因子α(TNF -α)水平的变化及其意义。方法 从 3 2例内异症患者 (轻度组 13例 ,为Ⅰ ,Ⅱ期 ,重度组 19例 ,为Ⅲ ,Ⅳ期 )和 19例对照者 (对照组 ,为行输卵管结扎术和吻合术患者 )的腹腔液中获取自然杀伤细胞 ,同时收集上清液。用放射性同位素法测定NK细胞活性 ,用酶联免疫吸附法测定IL -6,IL -8和TNF -α的水平。结果 内异症轻度组和重度组NK细胞活性均显著低于对照组 (P <0 .0 1) ,重度组显著低于轻度组 (P <0 0 1) ,轻度组和重度组IL -6,IL -8及TNF -α水平均明显高于对照组 ,差异有极显著性 (P <0 0 1) ;重度组显著高于轻度组 (P <0 0 1)。结论 内异症患者腹腔液中免疫功能紊乱 ,NK细胞活性受损 ,细胞因子IL -6,IL -8,TNF -α产生过量 ,且NK细胞活性受损程度及产生细胞因子的量随疾病分期的增加而增高 。

白细胞介素15和粒-单核集落刺激因子激活的自然杀伤T细胞对神经母细胞瘤细胞的杀伤作用

目的 研究白细胞介素 15 (IL 15 )和粒 单核集落刺激因子 (GM CSF)对健康儿童自然杀伤T细胞(NKT)增殖和对NKT细胞介导的神经母细胞瘤 (NB)细胞的细胞毒作用的影响。方法 采集分离健康儿童外周血T细胞 ,分别加入IL 15 ,GM CSF培养 ,MTT法检测T细胞增殖程度的变化 ,流式细胞仪检测NKT/T比例并分选出NKT细胞 ,MTT法检测NKT细胞对NB细胞毒作用。结果 IL 15刺激组、GM CSF刺激组和IL 15 +GM CSF刺激组T细胞增殖程度分别是对照组的 1.2 5倍、1.2倍和 1.4倍 (均P <0 .0 1) ;NKT/T比例分别是对照组的 2 .5 6倍、3.2 7倍和 4 .39倍 (P <0 .0 1或 0 .0 5 ) ;GM CSF组和IL 15 +GM CSF组NKT细胞毒作用高于对照组 (均P <0 .0 1) ,IL 15组NKT细胞毒作用与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5 )。与GM CSF组比较 ,IL 15 +GM CSF组T细胞增殖程度增高但NKT/T比例和NKT细胞毒作用差异无显著性。与IL 15组比较 ,IL 15+GM CSF组NKT/T比例和NKT细胞毒作用增高但T细胞增殖程度差异无显著性。IL 15组与GM CSF组T细胞增殖程度、NKT/T比例和细胞毒作用差异无显著性。结论 NKT细胞对NB具有细胞毒作用 ,IL 15和GM CSF联合应用可以促进健康儿童外周血NKT细胞增殖 ,增强NKT细胞对NB细胞毒作用。

支原体肺炎患儿自然杀伤细胞检测及转移因子对该细胞的作用

目的探讨NK细胞与支原体肺炎的关系,并探讨转移因子对NK细胞的作用。方法采用流式细胞仪技术检测60例MPP患儿外周血NK细胞百分率,并以30例健康儿童作对照;60例MPP患儿分为两组,MPP治疗组予以口服阿奇霉素和转移因子进行干预,MPP对照组仅口服阿奇霉素,剂量和疗程相同。结果 MPP组NK细胞百分率明显低于健康对照组(P<0.01);MPP治疗组干预后NK细胞百分率明显升高(P<0.01)。结论 MPP患儿的NK细胞百分率较低;转移因子可提高NK细胞百分率,增强细胞免疫功能。

自然杀伤T细胞、转录因子RORγt及Foxp3在白癜风患者外周血中的表达水平及其意义

【目的】探讨自然杀伤T细胞(NK-T)、孤独核受体(RORγt)、叉头翼状螺旋转录因子3(Foxp3)在白癜风患者外周血中的表达水平及其意义。【方法】选取2019年4月至2021年5月本院诊治的89例白癜风患者(观察组),另外选取同期在本院体检的36例健康志愿者(对照组)。检测并比较两组研究对象外周血NK-T、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平;比较不同病期、病型、皮损面积的白癜风患者外周血NK-T、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平,分析皮损面积与NK-T及RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平相关性。【结果】观察组患者外周血RORγt mRNA水平显著高于对照组,NK-T、Foxp3 mRNA水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);与稳定期相比,进展期患者RORγt mRNA水平较高,NK-T、Foxp3 mRNA水平较低,差异有统计学意义(P<0.05);不同病型的白癜风患者NK-T、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);不同皮损面积间NK-T、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);RORγt mRNA与皮损面积呈正相关(rs=0.509,P<0.05),NK-T、Foxp3 mRNA与皮损面积呈负相关(rs=-0.348、-0.307,P<0.05)。【结论】外周血NK-T及RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平异常与白癜风发病及病情发展密切相关,白癜风患者皮损面积与RORγt mRNA呈正相关,与NK-T、Foxp3 mRNA呈负相关。

阻断转化生长因子-β信号通路对自然杀伤细胞体外抗肿瘤效应的影响

目的将pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒转染原代NK细胞阻断其转化生长因子-β(TGF-β)信号,观察对人结肠癌细胞株HT-29的体外杀伤能力。方法将HT-29细胞与TGF-β1共孵育,使其终浓度为10ng/ml,采用AmaxaNucleofector技术分别将pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒和pIRES2-AcGFP空质粒转染原代NK细胞,活细胞计数试剂盒-8法检测二者对HT-29的体外杀伤活性。结果 pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒和绿色荧光蛋白空质粒的转染效率分别为18.85%和35.28%;Western blotting、RT-PCR证实DNTβRⅡ在NK细胞表达;与TGF-β1共孵育后,原代NK细胞的杀伤活性减弱(效靶比10∶1时14.40%±2.00%比26.14%±2.50%,P<0.05;效靶比20∶1时19.18%±2.49%比40.81%±3.50%,P<0.05);pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒转染组NK细胞的杀伤活性高于绿色荧光蛋白对照质粒转染组(效靶比10∶1时21.17%±2.49%比11.48%±1.11%,P<0.05;效靶比20∶1时35.30%±3.78%比17.19%±2.29%,P<0.05)。结论 pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒转染原代NK细胞提高了NK细胞的体外抗肿瘤活性,为NK细胞过继性免疫治疗提供了新的方法。

恶性肿瘤患者血清自然杀伤细胞抑制因子的观察

观察了20例恶性肿瘤患者血清对正常人自然杀伤细胞（NKC）活性的影响，发现荷瘤者血清可使正常人NKC活性明显抑制，其抑制率达78.9％，伴转移癌患者血清的抑制率明显高于不伴转移者。同时证实，癌症患者血清NKC抑制因子活性可被消炎痛部分阻断，而一定剂量的白细胞介素-2则无明显阻断作用，提示癌症患者血清存在的NKC抑制因子与肿瘤的发生发展密切相关，其本质可能是多因素的。

人外周血自然杀伤T细胞分泌胰岛素样生长因子-1的研究

目的：建立人外周血自然杀伤T细胞（NKT）体外扩增及检测NKT细胞分泌胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的方法。方法：采用IFN-γ，CD3和IL-2的方法从人外周血单个核细胞（PBMC）中扩增出NKT细胞，采用流式细胞仪检测扩增效率，并使用绝对实时定量PCR（real-timePCR）的方法检测扩增出的NKT细胞中IGF-1的mRNA表达量。使用内源性管家基因GAPDH校正误差。结果：两周扩增后NKT细胞增加了4倍。受试者扩增的NKT细胞IGF-1mRNA表达量为1．29-I-0．56拷贝数／10^6GAPDH。结论：从PBMC扩增NKT细胞可以获得良好的效果，扩增出的NKT细胞有IGF-1的表达，但是表达量相对较低。

手足口病患儿血清细胞因子及自然杀伤细胞表达的变化及临床意义

目的观察手足口病(HFMD)患儿血清细胞因子及自然杀伤(NK)细胞表达的变化,并探讨其临床意义。方法将56例HFMD患儿根据病情轻重分为轻症组31例和重症组25例,另选取同期健康体检儿童30例设为对照组,分别检测3组血清白细胞介素(IL)-6、IL-12、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及CD16+CD56+含量,并分析各指标与病情的相关性。结果轻症组血清IL-6、IL-12、TNF-α水平显著高于重症组及对照组,重症组仅IL-12水平高于对照组;重症组CD16+CD56+细胞含量显著高于轻症组和对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。相关性分析结果表明,IL-6和TNF-α表达水平与病情严重程度呈负相关(r=-0.467,-0.518,P<0.01)。结论 HFMD患儿血清细胞因子表达水平及免疫功能紊乱,检测IL-6、IL-12、TNF-α水平及CD16+CD56+含量有助于识别重症HFMD。

膀胱癌细胞高表达E2因子转录因子家族成员3a(E2F3a)通过上调CD24抑制NK细胞的杀伤

目的 探讨膀胱癌细胞过表达E2因子转录因子家族成员3a(E2F3a)后是否影响自然杀伤(NK)细胞的活化及杀伤并探讨其具体机制。方法 利用慢病毒载体构建E2F3a稳定过表达的人及小鼠膀胱癌细胞株并将其与NK细胞共孵育,乳酸脱氢酶释放实验及流式细胞术检测NK细胞活化及杀伤能力的变化。转录组测序分析膀胱癌细胞E2F3a过表达组与对照组之间的基因表达差异,免疫组织化学染色法检测膀胱癌组织中E2F3a与差异基因在蛋白水平上表达的相关性。进一步利用染色质免疫沉淀(ChIP)、实时定量PCR、 Western blot法及小干扰RNA(siRNA)等方法探索膀胱癌细胞过表达E2F3a后对NK细胞活化及杀伤影响的具体机制。结果 在膀胱癌细胞中过表达E2F3a能显著抑制NK细胞的活化及杀伤。膀胱癌细胞过表达E2F3a可显著上调CD24基因的表达,膀胱癌组织中E2F3a和CD24蛋白的表达呈显著正相关。CHIP结果显示,E2F3a能够结合CD24的启动子区并促进CD24基因的转录。干涉E2F3a过表达膀胱癌细胞中的CD24表达后,发现膀胱癌细胞E2F3a过表达所介导的NK细胞活化及杀伤抑制被显著缓解。结论 在膀胱癌细胞中E2F3a可结合CD24的启动子区促进CD24基因的转录及CD24蛋白的表达。膀胱癌细胞E2F3a通过上调CD24表达来抑制NK细胞的活化及杀伤。

信号传导及转录激活因子信号通路在自然杀伤细胞研究中的进展

自然杀伤(natural killer,NK)细胞在机体抗肿瘤免疫、抗感染免疫和生殖免疫中均发挥着重要的作用,对其信号通路的研究有助于更好地理解NK细胞的生物学行为。信号传导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)信号通路在NK细胞的生长发育和功能调控中发挥着重要的作用,是近年来研究较多的通路。激活NK细胞内的STAT1、STAT4、STAT5可以促进NK细胞的活性,有利于NK细胞行使其抗感染、抗肿瘤的作用。抑制NK细胞内的STAT3、STAT6亦可增强NK细胞的细胞毒性,但有些情况下会起到相反的作用。作者通过对近几年关于STAT信号通路在NK细胞中研究的调研,旨在促进NK细胞在转化医学中的研究和应用。

小鼠肝脏内Mac-1阴性自然杀伤细胞分泌细胞因子能力的研究

目的:研究小鼠肝脏内Mac-1阴性自然杀伤细胞分泌细胞因子的能力。方法:采用poly I:C和IL-2分别在体内和体外激活小鼠肝脏内的NK细胞,采用尼龙毛柱和免疫磁珠分选提纯Mac-1阴性和阳性自然杀伤细胞,用酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测IFN-γ、IL-4、IL-5三种细胞因子的分泌情况。结果:Mac-1阴性自然杀伤细胞优势分泌IL-4、IL-5;Mac-1阳性自然杀伤细胞优势分泌IFN-γ。结论:Mac-1阴性自然杀伤细胞属于NK2细胞亚群;Mac-1阳性自然杀伤细胞属于NK1细胞亚群。