实时定量PCR检测急性白血病细胞系自然杀伤细胞配体的表达

目的利用实时定量PCR方法检测急性白血病细胞系的NK配体表达，探讨不同来源白血病的NK配体差异表达规律。方法通过实时定量PCR方法，以p—actin为内参基因，分别检测急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞系（CEM、JurkatT、Reh）和急性髓系白血病（AML）细胞系（HL-60、KG-1a、NtM）表面23种NK配体（MICA、MICB、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-3、ULBP-4、HLA—E、HLA—G、CD48、NBTA、HLA—F、LLT-1、PVR、Nectin2、CD72、CD80、ICAM-1、LFA-3、CRACC、Fas、DR4、DR5、TNFRl）的表达情况，利用独立样本t检验进行组问比较。结果有4种NK配体的表达水平在ALL组和AML组间差异具有统计学意义。其中，ULBP-2ALL组（CEM细胞：1，JurkatT细胞：0．617，Reh细胞：0．246）高于AML组（HL-60细胞：0．000，KG-1a细胞：0．003，NB4细胞：0．000）（P=0．047），CD48、PVR（PVR一1、PVR一2）和DR4AML组（HL-60细胞分别为13．987、4．403、i0．334、8．71I，KG—la细胞分别为5．387、2．900、7．315、4．512，NB4细胞分别为7．763、3．248、7．049、6．127）高于ALL组（CEM细胞均为1，JurkatT细胞分别为2．035、1．553、3．888、0．449，Reh细胞分别为1．559、0．000、0．000、1．304）（P=0．044、0．014、0．014、0．011），而其余配体表达水平组间差异无统计学意义。结论ULBP-2、CD48、PVR和DR4可能是ALL和AML的差异表达基因，为应用基于NK细胞的过继免疫治疗打下基础。

自然杀伤细胞2族成员D及其配体在口腔肿瘤中的免疫调节作用

在人类,口腔恶性肿瘤十分常见且发病率高,对人类的健康和生命构成了极大的威胁。自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)与其配体主要组织相容性复合体1类相关分子结合可激活自然杀伤细胞,在肿瘤发生的早期启动机体的固有免疫监视和清除作用。NKG2D的配体主要有主要组织相容性复合体1类相关分子A和B以及UL16结合蛋白,深入研究NKG2D及其配体在口腔肿瘤免疫中的调节作用,有助于发掘新的有效对抗口腔肿瘤的治疗方式。本文就NKG2D及其配体在口腔肿瘤免疫中的调节作用等研究进展作一综述。

NKG2D CAR-NK92细胞构建及其对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用

目的 构建并鉴定靶向自然杀伤细胞2组成员D配体(NKG2DL)的嵌合抗原受体NK92(CAR-NK92)细胞[分泌白细胞介素15受体a与白细胞介素15的复合物(IL-15Ra-IL-15)],并验证NKG2D CAR-NK92细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤活性。方法 通过筛选NKG2D的胞外段连接4-1BB、 CD3ζ、 IL-15Ra-IL-15序列构建CAR载体,包装慢病毒并转导NK92细胞,获得NKG2D CAR-NK92细胞;CCK-8法检测NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力,ELISA检测其IL-15Ra的分泌,乳酸脱氢酶(LDH)法检测其杀伤效率;流式细胞术检测细胞活化性受体NK细胞受体p30(NKp30)、 NKp44、 NKp46的表达,凋亡细胞群的比例以及CD107α表达、胞内颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)的释放,以进一步验证NKG2D CAR-NK92细胞对肿瘤的细胞毒性作用机制;通过NKG2D抗体抑制效应细胞、组胺抑制肿瘤细胞后,LDH法检测对细胞杀伤效率的影响;构建NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型,验证其体内抗肿瘤活性。结果 慢病毒转导后,NK92细胞的NKG2D表达显著增加;与NK92细胞相比,NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力稍弱,早期凋亡细胞群少于其亲本NK92细胞;NKG2D CAR-NK92对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性更强,在其培养上清液中可检测到IL-15Ra的分泌;NKp44蛋白在NKG2D CAR-NK92细胞上的表达量显著增加,活化效应增强;抑制试验显示,CAR-NK92细胞对MHC-Ⅰ类链相关蛋白A(MICA)和MICB阳性的肿瘤细胞的细胞毒性作用更依赖于NKG2D CAR和NKG2DL的相互作用;NKG2D CAR-NK92细胞经肿瘤细胞刺激后,granzyme B和perforin表达增加,且NK细胞显著上调CD107α的表达;在高度免疫缺陷NCG小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型中,经NKG2D CAR-NK92细胞治疗的小鼠肿瘤明显缩小,且体质量无明显下降。结论 成功构建一种靶向NKG2DL的CAR-NK92细胞(分泌IL-15Ra-IL-15),其对多发性骨髓细胞的杀伤作用明显。

P13K/mTOR信号通路参与调控KG1a细胞NKG2D配体的表达

目的:自然杀伤细胞活化性受体(NKG2D)配体的低表达是白血病干细胞(LSC)逃避免疫杀伤的关键因素,磷脂酰肌醇3-激酶/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/mTOR)信号通路在LSC中高度活化,探讨PI3K/mTOR信号通路是否参与调控LSC中NKG2D配体的表达。方法:采用PI3K/mTOR信号通路抑制剂NVP-BEZ235对人急性骨髓白血病细胞(KG1a细胞)进行干预后,采用细胞技术试剂盒CCK-8检测KG1a细胞增殖,采用流式细胞术检测KG1a细胞周期及凋亡,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)及免疫印迹(Western blot)检测细胞中NKG2D配体MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3的表达。结果:抑制剂NVP-BEZ235显著抑制KG1a细胞的增殖,并将KG1a细胞周期阻滞于细胞周期G0/G1期;NVP-BEZ235抑制剂干预后,KG1a细胞NKG2D配体MICB信使核糖核酸(mRNA)相对表达量显著升高,ULBP1、ULBP2、ULBP3、mRNA及蛋白表达量也显著升高。结论:PI3K/mTOR调控LSC的增殖及周期,且其能够调控NKG2D的表达,该结果为通过PI3K/mTOR抑制靶向治疗耐药的LSC提供了数据支持。

多靶点酪氨酸激酶抑制剂联合NK细胞的抗肝癌作用及其分子机制

目前,针对晚期肝癌无标准和令人满意的治疗方法。多靶点酪氨酸激酶抑制剂(multi-target tyrosine kinase inhibitor,MTKI)联合NK细胞对肝癌细胞具有协同杀伤作用:一方面,MTKI能阻断肿瘤细胞增殖和血管生成信号通路促进细胞凋亡;另一方面,MTKI诱导肿瘤细胞表达NK细胞活化性配体(natural killer group 2 member D ligand,NKG2DL),促进肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性。MTKI诱导肿瘤细胞表达NKG2DL,主要通过DNA损伤修复反应分子和细胞凋亡通路与转录因子NF-κB(nuclear factor-κB)之间相互作用,活化由NF-κB2和Rel B组成的旁路途径调节NKG2DL的转录和表达。MTKI通过NF-κB旁路途径诱导肿瘤表达NKG2DL的分子机制为MTKI联合NK细胞治疗肝细胞癌提供了理论依据。