自然杀伤细胞2组成员A、程序性死亡因子配体1表达检测对PD-L1阻断免疫治疗肌层浸润性膀胱癌反应性的预测价值

目的:探究自然杀伤细胞2组成员A(NKG2A)及程序性死亡因子配体1(PD-L1)表达检测对PD-L1阻断免疫治疗肌层浸润性膀胱癌反应性的预测价值。方法:选取100例肌层浸润性膀胱癌患者作为研究对象,对其行PD-L1阻断免疫治疗后,根据治疗反应性将其分为缓解组和未缓解组;对缓解组患者随访3个月,将其分为复发组和未复发组。比较两组患者NKG2A和PD-L1在CD4^(+)和CD8^(+)上的表达水平,采用ROC曲线分析NKG2A和PD-L1预测膀胱癌患者治疗反应性的价值。结果:100例研究对象中,缓解组患者72例(72.00%),未缓解组患者28例(28.00%),两组性别、年龄比较无统计学差异(均P>0.05),但缓解组患者肿瘤直径小于未缓解组,NKG2A、PD-L1/CD4^(+)和PD-L1/CD8^(+)表达水平均低于未缓解组(均P<0.05)。膀胱癌患者NKG2A、PD-L1/CD4^(+)和PD-L1/CD8^(+)表达预测免疫治疗后缓解的AUC值分别为0.771、0.724、0.710;联合诊断的AUC为0.836。72例缓解患者中,出现复发29例(40.28%),未出现复发43例(59.72%),两组性别、年龄以及肿瘤直径比较无统计学差异(均P>0.05),但复发组NKG2A、PD-L1/CD4^(+)和PD-L1/CD8^(+)表达水平均高于未复发组(均P<0.05)。NKG2A、PD-L1/CD4^(+)和PD-L1/CD8^(+)表达预测膀胱癌患者缓解后复发的AUC值分别为0.775、0.740、0.728;联合诊断的AUC为0.874。结论:NKG2A、PD-L1/CD4^(+)和PD-L1/CD8^(+)在不同治疗反应性肌层浸润性膀胱癌患者外周血中表达水平不同,三者对于膀胱癌患者PD-L1阻断免疫治疗反应性均有一定的预测价值,且三者联合预测效能最佳。

流体剪切力通过NKG2D促进自然杀伤细胞对循环肿瘤细胞的胞毒性

目的肿瘤细胞主要通过血液循环系统进行转移。在血管中,自然杀伤细胞(NK细胞)是负责杀伤循环肿瘤细胞的主要免疫细胞,而血流剪切力这一循环系统特有的力学因素对NK细胞杀伤循环肿瘤细胞的影响尚不清楚。方法本研究利用体外循环系统模拟血流剪切微环境,在NK细胞和乳腺癌肿瘤细胞进行共培养时探究流体剪切力对NK细胞胞毒性的影响以及NK细胞感知流体剪切力的方式。结果研究发现,流体剪切力通过促进颗粒酶的释放增强NK细胞的胞毒性。NK细胞通过膜受体NKG2D感知流体剪切力,进而促进NK细胞的活化和脱颗粒。进一步的研究发现,逃逸NK细胞杀伤的肿瘤细胞表现出独特的器官转移偏好性。这种偏好性依赖于膜张力改变引起的下游信号通路的启动,从而促进了相关转移基因的表达。结论流体剪切力通过作用于NK细胞表面膜受体NKG2D促进其活化和对肿瘤细胞胞毒性,抑制肿瘤细胞通过循环系统进行转移。

膀胱癌细胞高表达E2因子转录因子家族成员3a(E2F3a)通过上调CD24抑制NK细胞的杀伤

目的 探讨膀胱癌细胞过表达E2因子转录因子家族成员3a(E2F3a)后是否影响自然杀伤(NK)细胞的活化及杀伤并探讨其具体机制。方法 利用慢病毒载体构建E2F3a稳定过表达的人及小鼠膀胱癌细胞株并将其与NK细胞共孵育,乳酸脱氢酶释放实验及流式细胞术检测NK细胞活化及杀伤能力的变化。转录组测序分析膀胱癌细胞E2F3a过表达组与对照组之间的基因表达差异,免疫组织化学染色法检测膀胱癌组织中E2F3a与差异基因在蛋白水平上表达的相关性。进一步利用染色质免疫沉淀(ChIP)、实时定量PCR、 Western blot法及小干扰RNA(siRNA)等方法探索膀胱癌细胞过表达E2F3a后对NK细胞活化及杀伤影响的具体机制。结果 在膀胱癌细胞中过表达E2F3a能显著抑制NK细胞的活化及杀伤。膀胱癌细胞过表达E2F3a可显著上调CD24基因的表达,膀胱癌组织中E2F3a和CD24蛋白的表达呈显著正相关。CHIP结果显示,E2F3a能够结合CD24的启动子区并促进CD24基因的转录。干涉E2F3a过表达膀胱癌细胞中的CD24表达后,发现膀胱癌细胞E2F3a过表达所介导的NK细胞活化及杀伤抑制被显著缓解。结论 在膀胱癌细胞中E2F3a可结合CD24的启动子区促进CD24基因的转录及CD24蛋白的表达。膀胱癌细胞E2F3a通过上调CD24表达来抑制NK细胞的活化及杀伤。

自然杀伤细胞受体家族NKG2D研究进展

NKG2D是自然杀伤细胞的一种激活性受体 ,与其配体MICA和MICB结合后 ,在多肽DAP 10P的介导下激活自然杀伤细胞 ,导致表达MHC和MICA/B分子的靶细胞被杀伤 ,在肿瘤的免疫监视中发挥重要的作用。UL16结合蛋白 (ULBPs)是NKG2D的另一种新的配体分子 。

NKG2A-HLA-E轴介导NK细胞应答在病毒感染性疾病中的作用及机制研究进展

自然杀伤(NK)细胞主要通过迅速释放细胞毒性介质以及细胞因子直接杀伤病毒感染的靶细胞。NK细胞表面抑制性和活化性受体的平衡以及靶细胞上相应配体的表达均参与调控NK细胞的杀伤功能。其中NK细胞2组成员A(NKG2A)是NK细胞上备受关注的抑制性受体之一,通过与其配体人类白细胞抗原E(HLA-E)的相互作用,可抑制NK细胞对自身正常组织细胞的杀伤活性。研究发现病毒感染细胞表面HLA-E表达上调,并且可与病毒蛋白来源的多肽结合形成复合物,通过与NKG2A的相互作用调控NK细胞功能,从而参与病毒感染性疾病发病过程。本文总结了NKG2A与HLA-E分子互作特点,以及NKG2A-HLA-E轴参与调控NK细胞的功能机制,有助于了解NK细胞在病毒感染性疾病中的重要作用。

主要组织相容性复合体-Ⅰ类分子链相关蛋白A-自然杀伤细胞2族成员D通路及其在头颈部鳞状细胞癌中的研究进展

主要组织相容性复合体-Ⅰ类分子链相关蛋白A(MICA)作为自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)的配体,与其特异性结合,活化以自然杀伤细胞为主的免疫效应细胞,发挥免疫监视作用。本文就近5年来有关MICA-NKG2D通路的表达、调控及其在头颈部鳞状细胞癌中的研究进展作一综述。

自然杀伤细胞2族成员D及其配体在口腔肿瘤中的免疫调节作用

在人类,口腔恶性肿瘤十分常见且发病率高,对人类的健康和生命构成了极大的威胁。自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)与其配体主要组织相容性复合体1类相关分子结合可激活自然杀伤细胞,在肿瘤发生的早期启动机体的固有免疫监视和清除作用。NKG2D的配体主要有主要组织相容性复合体1类相关分子A和B以及UL16结合蛋白,深入研究NKG2D及其配体在口腔肿瘤免疫中的调节作用,有助于发掘新的有效对抗口腔肿瘤的治疗方式。本文就NKG2D及其配体在口腔肿瘤免疫中的调节作用等研究进展作一综述。

肿瘤患者自然杀伤细胞受体NKG2A和NKG2D的表达

目的通过研究肿瘤患者外周血自然杀伤(NK)细胞表面NKG2A和NKG2D的表达情况,探讨二者表达失衡与肿瘤免疫逃逸的关系。方法采用流式细胞术检测40例肿瘤患者和10名正常对照者外周血NK细胞表面NKG2A和NKG2D的表达情况。用全自动五分类血液分析仪测定各病例的血常规。结果肿瘤患者和正常对照组白细胞数值差异无统计学意义;肿瘤患者淋巴细胞比率低于对照组,而NK细胞明显高于对照组;肿瘤患者NK细胞表面抑制性受体NKG2A和活化性受体NKG2D均明显高于对照组,但肿瘤患者NKG2D荧光强度呈降低趋势。结论肿瘤患者NK细胞表面NKG2A/NKG2D表达失衡,可能是肿瘤免疫逃逸的机制之一。

NKG2D CAR-NK92细胞构建及其对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用

目的 构建并鉴定靶向自然杀伤细胞2组成员D配体(NKG2DL)的嵌合抗原受体NK92(CAR-NK92)细胞[分泌白细胞介素15受体a与白细胞介素15的复合物(IL-15Ra-IL-15)],并验证NKG2D CAR-NK92细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤活性。方法 通过筛选NKG2D的胞外段连接4-1BB、 CD3ζ、 IL-15Ra-IL-15序列构建CAR载体,包装慢病毒并转导NK92细胞,获得NKG2D CAR-NK92细胞;CCK-8法检测NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力,ELISA检测其IL-15Ra的分泌,乳酸脱氢酶(LDH)法检测其杀伤效率;流式细胞术检测细胞活化性受体NK细胞受体p30(NKp30)、 NKp44、 NKp46的表达,凋亡细胞群的比例以及CD107α表达、胞内颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)的释放,以进一步验证NKG2D CAR-NK92细胞对肿瘤的细胞毒性作用机制;通过NKG2D抗体抑制效应细胞、组胺抑制肿瘤细胞后,LDH法检测对细胞杀伤效率的影响;构建NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型,验证其体内抗肿瘤活性。结果 慢病毒转导后,NK92细胞的NKG2D表达显著增加;与NK92细胞相比,NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力稍弱,早期凋亡细胞群少于其亲本NK92细胞;NKG2D CAR-NK92对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性更强,在其培养上清液中可检测到IL-15Ra的分泌;NKp44蛋白在NKG2D CAR-NK92细胞上的表达量显著增加,活化效应增强;抑制试验显示,CAR-NK92细胞对MHC-Ⅰ类链相关蛋白A(MICA)和MICB阳性的肿瘤细胞的细胞毒性作用更依赖于NKG2D CAR和NKG2DL的相互作用;NKG2D CAR-NK92细胞经肿瘤细胞刺激后,granzyme B和perforin表达增加,且NK细胞显著上调CD107α的表达;在高度免疫缺陷NCG小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型中,经NKG2D CAR-NK92细胞治疗的小鼠肿瘤明显缩小,且体质量无明显下降。结论 成功构建一种靶向NKG2DL的CAR-NK92细胞(分泌IL-15Ra-IL-15),其对多发性骨髓细胞的杀伤作用明显。

苹果酸舒尼替尼诱导高表达三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2的耐药鼻咽癌细胞高表达NKG2D配体

目的:探讨苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate,SU11248)对高表达三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette superfamily G member2,ABCG2)耐药鼻咽癌细胞CNE2/DDP(ABCG2highCNE2/DDP)表达NKG2D配体的诱导作用。方法:利用免疫磁珠技术分离ABCG2highCNE2/DDP细胞及同种异体反应性自然杀伤细胞(allo-reactive natural kill cell,Allo-NK),流式细胞技术检测分离后细胞的纯度及苹果酸舒尼替尼处理前后ABCG2highCNE2/DDP细胞NKG2D配体表达率,LDH释放测定法检测苹果酸舒尼替尼处理前后ABCG2highCNE2/DDP细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性。结果:ABCG2highCNE2/DDP细胞分离后ABCG2的表达率为(91.40±2.32)%,Allo-NK细胞分选后CD3-CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上。经苹果酸舒尼替尼处理后,ABCG2highCNE2/DDP细胞的NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达率由药物处理之前的(2.92±0.33)%、(4.27±0.33)%、(5.80±0.62)%、(11.10±3.15)%、(7.75±1.14)%分别上升到(89.12±4.56)%、(66.10±2.22)%、(67.56±4.19)%、(69.37±8.83)%、(63.28±3.31)%。在效靶比为10∶1、20∶1时,苹果酸舒尼替尼处理前后Allo-NK细胞对ABCG2highCNE2/DDP细胞的杀伤率分别为(15.32±13.86)%、(27.26±6.81)%及(41.12±4.12)%、(57.25±2.37)%,处理后的杀伤率有明显的提高(F=15.58,P=0.000)。结论:苹果酸舒尼替尼通过诱导高表达NKG2D配体(MICA/B、ULBP1-3),使ABCG2highCNE2/DDP细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性明显增强。

索拉非尼对高表达三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2的鼻咽癌细胞杀伤敏感性的影响的研究

目的探讨索拉非尼提高高表达三磷酸腺苷(ATP)结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)的人耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞(简写作ABCG2High细胞)对同种异体反应性自然杀伤(Allo-NK)细胞的杀伤敏感性及其相关机制。方法利用免疫磁珠技术分离ABCG2High CNE2/DDP和Allo-NK细胞,并设3个实验组:①处理组(经索拉非尼10ng/ml共孵育4h的ABCG2High CNE2/DDP细胞);②未处理组(常规培养的ABCG2High CNE2/DDP细胞);③对照组(常规培养的K562细胞)。流式细胞技术检测处理组和未处理组细胞的ABCG2表达率和5种NKG2D配体(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表达率。乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法检测Allo-NK细胞对各实验组细胞的杀伤率。结果分离后的CNE2/DDP细胞的ABCG2表达率为91.40%±2.32%,分选出的CD3-CD16+CD56+(Allo-NK)细胞纯度大于90%。未处理组的ABCG2High CNE2/DDP细胞的NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达率分别为2.92%±0.33%、4.27%±0.33%、5.80%±0.62%、11.10%±3.15%、7.75%±1.14%,而处理组明显升高(分别为10.38%±1.23%、10.68%±1.26%、11.62%±1.22%、43.24%±4.42%、11.91%±0.88%;P<0.05)。在效靶比为10∶1、20∶1时,Allo-NK细胞对未处理组靶细胞的杀伤率为15.32%±1.34%、27.26%±6.81%,而对处理组靶细胞杀伤率为27.75%±4.12%、43.17%±5.92%,两组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论索拉非尼通过诱导肿瘤细胞高表达NKG2D配体,使其对Allo-NK细胞的杀伤敏感性增强。

NKG2D配体介导雷帕霉素对自然杀伤细胞的间接抑制作用

目的探讨雷帕霉素对高表达三磷酸腺苷(ATP)结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)人耐药鼻咽癌细胞CNE2/DDP(简写为ABCGH2ighCNE2/DDP)NKG2D配体表达及其对NK(NaturalkillerNK)细胞杀伤活性的影响。方法利用免疫磁珠技术分离ABCGH2ighCNE2/DDP细胞及NK细胞,流式细胞技术检测分离后细胞纯度及经雷帕霉素处理前后靶细胞NKG2D配体表达率,LDH释放测定法检测经雷帕霉素处理前后ABCG2HighCNE2/DDP细胞对NK细胞的杀伤敏感性。结果ABCG2HighCNE2/DDP细胞分离后ABCG2表达率为(91.40±2.32)%,分选后NK细胞CD3-CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上,经雷帕霉素处理之后靶细胞MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达率,由药物处理之前的(2.92±0.33)%、(4.27±0.33)%、(5.80±0.62)%、(11.10±3.15)%、(7.75±1.14)%分别下降到(1.50±0.36)%、(2.36±0.72)%、(2.24±0.12)%、(5.06±1.16)%、(3.94±0.78)%。在效靶比为10∶1、20∶1时,NK细胞对雷帕霉素处理前后ABCGH2ighCNE2/DDP细胞的杀伤率由处理前的(15.32±1.34)%、(27.26±2.02)%下降到(10.82±0.73)%、(22.72±2.03)%,处理前后杀伤率差异有显著性(F=71.40P=0.000)。结论雷帕霉素通过诱导肿瘤细胞低表达NKG2D配体(MICA/B、ULBP1-3),间接抑制了NK细胞的杀伤活性。

舒尼替尼诱导自然杀伤细胞2族成员D配体表达对自然杀伤细胞杀伤舌鳞癌CAL27细胞敏感性的影响

目的探讨舒尼替尼诱导自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体(NKG2DL)的表达对自然杀伤(NK)细胞杀伤舌鳞癌CAL27细胞敏感性的影响。方法将对数生长期的CAL27细胞分为未处理组和舒尼替尼组,舒尼替尼组采用舒尼替尼处理,未处理组细胞未经舒尼替尼处理。采用细胞克隆形成实验检测两组CAL27细胞的增殖能力;采用流式细胞术检测两组CAL27细胞的凋亡、NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3)阳性细胞的表达及健康人NK细胞的纯度;采用免疫蛋白印迹法检测两组CAL27细胞中NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3)蛋白的表达水平。再将舒尼替尼组分为舒尼替尼-NKG2D组和舒尼替尼-对照组,舒尼替尼-NKG2D组加入经NKG2D单抗处理后的NK细胞,舒尼替尼-对照组加入未经NKG2D单抗处理的NK细胞,同时未处理组加入未经NKG2D单抗处理的NK细胞(作为未处理-NK组)。采用乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞对CAL27细胞的杀伤敏感性。结果(1)与未处理组相比,舒尼替尼组CAL27细胞的增殖能力降低、凋亡率增加,CAL27细胞中的MICA、MICB、ULBP1和ULBP2蛋白表达水平均升高(均P<0.05),而两组CAL27细胞ULBP3蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。(2)与未处理-NK组相比,NK细胞对经舒尼替尼处理的CAL27细胞的杀伤敏感性增强(均P<0.05)。(3)采用NKG2D抗体封闭NK细胞表面的NKG2D受体后,NK细胞对经舒尼替尼处理的CAL27细胞的杀伤敏感性低于未采用NKG2D单抗处理的CAL27细胞的杀伤敏感性(均P<0.05)。结论舒尼替尼可以抑制舌鳞癌细胞CAL27细胞的增殖,促进其凋亡,上调CAL27细胞中NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2)的表达水平,增强NK细胞对CAL27细胞的杀伤敏感性。

共培养体系中IL-15通过激活NK细胞ULBP1/NKG2D信号抑制食管癌细胞的迁移和侵袭

目的:探讨IL-15对食管癌细胞和自然杀伤(NK)细胞共培养体系中NK细胞活性以及对食管癌细胞迁移和侵袭的影响和机制。方法:qRT-PCR和Western blot检测人正常食管上皮细胞(HEEC)和食管癌细胞系TE-1中IL-15水平。TE-1与NK细胞共培养,共培养体系分为对照组(无处理)、IL-15组(0.2、0.4、0.8μg/ml的IL-15)、IL-15+anti-NKG2D组[UL16结合蛋白/自然杀伤组蛋白2D(ULBP1/NKG2D)的阻断剂anti-NKG2D联合IL-15(0.8μg/ml)]、anti-NKG2D组、IL-15+anti-ASIALO-GM1组[NK细胞抑制剂anti-ASIALO-GM1联合IL-15(0.8μg/ml)]及anti-ASIALO-GM1组。细胞划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测TE-1细胞的迁移和侵袭能力,CCK-8法检测NK细胞增殖率,Western blot检测各组NK细胞表面ULBP1/NKG2D表达,免疫共沉淀技术检测NKG2D与ULBP1的相互作用。结果:TE-1细胞中IL-15水平低于HEEC细胞(P<0.05)。0.2、0.4、0.8μg/ml IL-15处理共培养体系提高NK细胞增殖率,但降低TE-1细胞的迁移率和侵袭率(均P<0.05)。在TE-1与NK细胞的共培养体系中,IL-15组(0.8μg/ml)NK细胞膜蛋白ULBP1和NKG2D水平较对照组上调(均P<0.05);anti-NKG2D抑制了NKG2D表达,并抑制了NKG2D与ULBP1的相互作用,与IL-15(0.8μg/ml)组相比,IL-15+anti-NKG2D组NKG2D表达水平和NK细胞增殖率均降低(均P<0.05),但TE-1细胞的迁移率和侵袭率升高(均P<0.05),且NK细胞抑制剂anti-ASIALO-GM1与anti-NKG2D的作用效果一致。结论:IL-15通过激活细胞表面ULBP1/NKG2D信号促进NK细胞活性,从而抑制食管癌细胞的迁移和侵袭。

苦参碱通过诱导NKG2D配体高表达增强NK细胞对ABCG2high耐药鼻咽癌细胞杀伤活性

目的探讨苦参碱提高ABCG2High[三磷酸腺苷(ATP)结合转运蛋白G超家族成员2]耐药鼻咽癌细胞对Allo-NK细胞杀伤敏感性的机制。方法利用免疫磁珠技术分离ABCG2HighCNE2/DDP细胞及Allo-NK细胞,流式细胞技术检测分离后细胞纯度及经苦参碱处理前后靶细胞NKG2D配体表达率,LDH释放测定法检测经苦参碱处理前后ABCG2HighCNE2/DDP细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性。结果ABCG2HighCNE2/DDP细胞分离后ABCG2表达率为(91.40±2.32)%,分选后NK细胞CD3-CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上,经苦参碱处理之后靶细胞MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达率,由药物处理之前的(2.92±0.33)%、(4.27±0.33)%、(5.80±0.62)%、(11.10±3.15)%、(7.75±1.14)%分别上升到(11.30±0.89)%、(14.29±2.61)%、(12.56±1.06)%、(43.24±4.43)%、(12.77±1.06)%。在效靶比为10:1、20:1,Allo-NK细胞对苦参碱处理前后ABCG2HighCNE2/DDP细胞的杀伤率分别为(15.32±1.34)%、(27.26±6.81)%及(28.53±1.37)%、(42.72±2.80)%。处理前后杀伤率有显著性差异(F=29.05,P=0.000)。结论苦参碱通过诱导肿瘤细胞高表达NKG2D配体(MICA/B、ULBP1-3),使肿瘤细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性增强。

NKG2D介导NK细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究

目的探讨鼻咽癌CNE2细胞表面HLA-I类分子表型和NKG2D配体的表达情况,进一步了解其对同种异体NK细胞杀伤活性的影响。方法流式细胞仪检测NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3在K562、CNE2细胞的表达情况。PCR-SSP法分析CNE2细胞HLA-A、B、Cw分型和NK细胞KIR分型。LDH释放法测定5例健康者NK细胞在不同效靶比时对K562、CNE2细胞的杀伤活性,效靶比20∶1时观察抗NKG2D配体的单抗对NK细胞杀伤K562、CNE2细胞活性的影响。结果CNE2细胞表达MICA、MICB、ULBP2,不表达ULBP1、ULBP3。K562细胞表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。5例健康者NK细胞抑制性KIR与CNE2细胞表面的HLA-I类分子之间存在错配。效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时NK细胞对K562、CNE2细胞的杀伤活性分别为(29.02±0.45)%、(10.50±2.17)%;(44.43±1.36)%、(27.68±1.47)%;(57.82±1.35)%、(36.99±3.13)%;(71.24±2.36)%、(55.00±2.20)%,在各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较CNE2细胞明显增强(P=0.000);在效靶比20∶1时anti-MICA、anti-MICB、anti-ULBP1、anti-ULBP2、anti-ULBP3可明显抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性,与阻断前相比有显著性差异(P=0.000);anti-MICA、anti-MICB、anti-ULBP2可明显抑制NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性,与阻断前相比有显著性差异(P<0.01),但anti-ULBP1、anti-ULBP3不能阻断NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性。结论NKG2D配体影响NK细胞对靶细胞的杀伤活性,提高NKG2D配体的表达有可能提高NK细胞的抗肿瘤活性。

人鼻咽癌细胞株CNE2对NK细胞KIR/NKG2D受体的免疫编辑作用及其对NK细胞杀伤功能的影响

目的探讨NK细胞与表达NKG2D配体的人鼻咽癌细胞株CNE2混合培养后4、24、48h时KIR、NKG2D的变化及其对NK细胞杀伤CNE2细胞活性的影响。方法PCR-SSP法检测CNE2细胞HLA-A、B、Cw表型、NK细胞KIR表型(选择3例健康者为试验对象),流式细胞仪检测对照组(新鲜分离的NK细胞)KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、NKG2D的表达情况。IL2组(IL2培养的NK细胞)、CNE2组(CNE2、IL2、NK细胞混合培养)培养后4、24、48h时KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、NKG2D的表达情况,LDH释放法测定IL2组及CNE2组培养24h后的NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性。结果CNE2细胞表面HLA-A、B、Cw表型为A2,24;B18,35;Cw4,7。3例健康者均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1。CNE2组4、24、48h时KIR2DL1、KIR2DL3表达较对照组、IL2组明显升高(P<0.01),NKG2D表达较对照组、IL2组明显降低(P<0.01),KIR3DL1表达与对照组、IL2组相比无明显变化(P>0.05)。IL2组4、24、48h时KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1及NKG2D表达与对照组相比无明显变化(P>0.05)。IL2组、CNE2组培养24h后的NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性在效靶比10∶1时分别为(26.96±1.47)%和(2.74±1.64)%,两者相比差异有统计学意义(P<0.01);效靶比20∶1时分别为(35.74±3.59)%和(4.57±2.41)%,两者相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论NK细胞与NKG2D配体阳性的肿瘤细胞持续性接触,下调NK细胞表面NKG2D表达,上调NK细胞表面与HLAI类分子相结合的KIR表达,导致NK细胞对靶细胞杀伤活性减低。本研究阐明了编辑后的NK细胞杀伤活性减低的分子基础,同时提示阻断HLAI类分子与KIR的结合或者增强NK细胞表面NKG2D的表达将有利于提高NK细胞杀伤肿瘤细胞的活性。

NKG2D配体的表达直接影响NK细胞对不同发育阶段DC的杀伤

目的:探讨NKG2D配体在不同发育阶段树突状细胞(DC)表面的表达及其对自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响。方法:用细胞因子(rhIL-4、rhGM-CSF、TNF-α)体外诱导培养单核细胞来源的未成熟树突状细胞(iDC)和成熟树突状细胞(mDC)并鉴定形态和表型,免疫磁珠法分离纯化NK细胞。流式细胞术(FCM)检测iDC和mDC表面NKG2D配体MICA/B、ULBP1-3的表达。用LDH释放法检测NK细胞对iDC和mDC的杀伤活性以及抗NKG2D单克隆抗体(mAb)阻断NK细胞后的杀伤活性。结果:培养的iDC和mDC具有典型的细胞形态和免疫表型特征。iDC表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP3,表达率分别为(32·39±8·30)%、(17·75±3·40)%、(26·71±6·48)%、(38·37±6·89)%;mDC表面表达MICA、ULBP3,表达率分别为(7·82±2·67)%、(8·36±2·42)%,比iDC表面相应配体表达率低(P<0·01)。各效靶比NK细胞对iDC的杀伤活性均比对mDC的杀伤活性高,差异有统计学意义(P<0·01)。抗NKG2D mAb阻断NK细胞后对iDC杀伤活性比阻断前减弱(P<0·05);对mDC的杀伤活性与阻断前相比无统计学意义(P>0·05)。结论:NKG2D配体在iDC表面表达高,介导了NK细胞对iDC的杀伤,而对mDC的杀伤无影响,是NK细胞对iDC选择性高杀伤的分子机制之一。

NKG2D配体在耐药鼻咽癌细胞的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

目的探讨NKG2D的主要活化性配体在鼻咽癌亲本细胞CNE2和多药耐药细胞CNE2DDP的表达及其对自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响。方法流式细胞仪检测NKG2D的主要活化性配体MHC-I类链相关蛋白A和B(MICA、MICB)、UL16结合蛋白1-3(ULBP1、ULBP2、ULBP3)在CNE2、CNE2DDP细胞的表达情况;PCR-SSP法检测CNE2、CNE2DDP细胞HLA-A、B、Cw分型和NK细胞KIR分型;LDH释放法测定5例健康者的NK细胞在不同效靶比时对CNE2、CNE2DDP细胞的杀伤活性;效靶比20∶1时观察不同单抗对NK细胞杀伤CNE2、CNE2DDP细胞活性的阻断作用。结果CNE2、CNE2DDP细胞HLA分型为A2,24,B18,35,Cw4,7;5例健康者的NK细胞表达KIR2DL1,KIR2DL3,KIR3DL1,KIR3DL2与CNE2、CNE2DDP细胞表面的HLA-I类分子之间存在错配。CNE2、CNE2DDP细胞均表达NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP2,均不表达ULBP1、ULBP3;CNE2细胞MICA、MICB的表达率与CNE2DDP细胞相比差异有统计学意义(P<0.01)。效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时NK细胞对CNE2、CNE2DDP细胞的杀伤活性分别是(10.50±2.17)%、(4.98±0.95)%;(27.68±1.47)%、(15.48±2.10)%;(36.99±3.13)%、(28.46±4.30)%;(55.00±2.20)%、(40.95±2.21)%。在各效靶比时NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性与CNE2DDP细胞相比差异有统计学意义(P<0.01);效靶比20∶1时anti-MICA、anti-MICB、anti-ULBP2单抗可明显抑制NK细胞对CNE2、CNE2DDP细胞的杀伤活性,与阻断前相比差异有统计学意义(P<0.05);anti-ULBP1、anti-ULBP3单抗不能阻断NK细胞对CNE2、CNE2DDP细胞的杀伤活性。结论NKG2D的主要活化性配体MICA、MICB在CNE2、CNE2DDP细胞的表达差异与NK细胞的杀伤活性有关,肿瘤细胞在发生多药耐药的同时获得了免疫逃避能力。

IL-2、IL-15增强免疫编辑后NK细胞NKG2D的表达及其对鼻咽癌CNE2细胞的杀伤活性

目的:观察IL-2、IL-15对免疫编辑后NK细胞NKG2D的表达及其对鼻咽癌CNE2细胞杀伤活性的影响。方法:抗CD56磁珠纯化NK细胞后分为4组:(1)编辑前NK细胞组:加入100 U/ml IL-2;(2)单纯编辑组:NK细胞与CNE2细胞10∶1混合,加入100U/ml IL-2;(3)IL-2再培养组:纯化编辑后的NK细胞,加入1 000 U/ml IL-2;(4)IL-15再培养组:纯化编辑后的NK细胞,加入10 ng/ml IL-15。24 h后,流式细胞仪检测各组NK细胞表面NKG2D的表达;LDH释放测定法测定效靶比20∶1时各组NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性。结果:编辑前NK细胞组、单纯编辑组、IL-2再培养组、IL-15再培养组NK细胞表面NKG2D的表达率分别为(97.63±0.83)%、(53.50±1.25)%、(94.47±1.00)%、(98.07±0.21)%。IL-2、IL-15再培养组NK细胞NKG2D的表达分别比单纯编辑组有显著的增加(P<0.01),该4组NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(35.90±3.27)%、(4.70±2.30)%、(31.70±3.56)%、(40.18±2.94)%,IL-2再培养组、IL-15再培养组明显提高编辑后NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性(P<0.01),IL-15的作用强于IL-2。结论:高剂量IL-2、IL-15可以上调免疫编辑后NK细胞表面NKG2D的表达,恢复编辑后NK细胞对鼻咽癌细胞CNE2的杀伤活性,IL-15的作用强于IL-2。