遗传工程微生物细胞间发生的自然遗传转化

将两株具有不同遗传标记的枯草芽孢杆菌在基本培养基中分别培养至对数生长后期后进行短时间混合静置培养 ,经选择平板筛选、DNaseI敏感性试验、质粒检测和产蛋白酶活性检测 ,发现两菌株之间可通过自然遗传转化进行染色体DNA和质粒DNA的交换。研究结果表明 ,自然遗传转化可在细胞间进行 ,这对揭示微生物群居的自然环境中可能存在的细胞间的DNA转移 ,以及正确评估遗传工程微生物(GEMs)的安全使用具有重要意义。

枯草芽孢杆菌在琼脂平板上进行的自然遗传转化

本文对发生在琼脂平板上的枯草芽孢杆菌自然遗传转化进行了初步的研究。结果表明，在相同条件下，该菌在琼脂平板上的自然转化率明显高于传统液体转化，并且转化反应对ＤＮａｓｅ 的抗性增强，通常被认为不能建立感受态的ＬＢ 培养物当涂布到平板上后也很快具有了自然转化的能力，说明在固相物表面进行的转化过程与传统的液体法存在一定的差异。在琼脂平板上，也能观察到具不同遗传标记的菌株间进行的细胞间自然转化。

环境中发生的自然遗传转化

遗传工程微生物（GMES）日益广泛的应用，促使人们的注意力开始转向环境中自然转化的研究，而环境（土壤、水体、沙粒子）中是否能发生自然转化，主要取决于环境中是否存在具有转化活性的DNA分子及可吸收DNA的感受态细胞．研究表明，几乎所有的生活细菌都可向环境中主动分泌或因细胞死亡裂解而释放DNA，这些DNA分子可与固型物（土壤、沙子等）结合而得到保护，免受DNase的降解，从而能长时间存留于环境中并具有转化活性。另一方面，自然感受态作为许多细菌应付不利生活条件的一种调节机制，在自然环境中的存在具有普遍性。所以自然转化很可能是自然环境中重要的基因转移机制。细菌（包括GMES）的基因能够通过这种转化过程在微生物群体中进行散布．

不同培养时期的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌间发生的跨属自然遗传转化

携带穿梭质粒的大肠杆菌与作为受体的枯草芽孢杆菌分别培养至不同生长阶段混合均匀后静置40min,涂布选择性平板,37℃培养30h后得到一定数目的转化子,DNaseⅠ敏感实验证实质粒是通过自然遗传转化而非其它形式发生转移。实验发现大肠杆菌可以在特定生长时期向胞外分泌DNA,并且在对数期具有最高的提供质粒的能力,而生长后期的细胞因为体系中DNase量的增加转化频率下降。进一步的研究发现枯草芽孢杆菌在营养丰富的LB培养基中也具有与基本培养基中相当的转化能力,并且在对数生长前期具有较高的转化频率。

遗传工程微生物细胞间发生的自然遗传转化

笔者结合了多年的工作经验,针对遗传工程微生物细胞间发生的自然遗传转化进行了初步探讨分析,主要是将两株不同DNA的枯草芽孢杆菌进行分别培养,认真观察其生长状态,并通过质粒检测、经选择平板筛选等数据分析得知,虽然这两株枯草芽孢杆菌的遗传基因不同,但是可以进行自然遗传转化的,实验证明,自然遗传转化是在物细胞中进行遗传基因的转移,这对于我国遗传工程微生物的使用质量有着至关重要的作用与意义。

通过DNA释放及感受态建立进行的枯草杆菌细胞间自然转化

以平板转化法研究了枯草杆菌在液体基本培养基 (MM)及LB中培养时通过DNA释放和感受态建立进行的细胞间自然转化 .结果表明 ,该菌在这两种培养基中培养时均可在对数生长期向培养液中主动分泌有生物活性的DNA ,且细胞间接触有利于转化过程的进行 ,暗示在本实验条件下DNA供体细胞可能具有某种主动功能 .对感受态建立的研究表明 ,不仅是MM培养物 ,而且通常被认为不能形成自然感受态的LB培养物 ,当涂布于MM选择平板后均可利用细胞分泌或提取的DNA进行自然转化 ,其转化高峰均出现在对数生长末期 ,转化频率分别可达到 3× 10 -3 和 1.9× 10 -6.

大肠杆菌在低Ca^(2+)条件下对外源DNA的摄取

含一定浓度 Ca2 +的 L B培养基 ,接种大肠杆菌 HB10 1,37℃振荡培养至 OD6 0 0 为 0 .5左右 ,培养前或培养后加入 p BR32 2质粒 ,4℃放置一段时间后经氨苄青霉素筛选和质粒检测发现 ,大肠杆菌不经过高 Ca2 + 下的冰浴处理和热激活等过程就能够直接摄取外源 DNA;通过对转化子质粒拷贝数和氨苄青霉素抗性测定发现 ,这种转化方式进入菌体内的质粒 DNA同样能够进行有效的复制和表达 ,与传统的人工转化结果无本质区别 ;在一定范围内 ,大肠杆菌的转化频率与环境中的 Ca2 + 浓度成正相关 ,并且这种准自然条件下的转化需要一定的时间 .