循环自由流等电聚焦方法的建立及应用研究

等电聚焦是利用蛋白质分子或其它两性电解质分子的等电点不同,在一个连续、稳定、线性的pH梯度中进行蛋白质分析分离的技术。薄层凝胶等电聚焦具有高分辨率,但上样量小,聚焦后样品分析处理不便,仅局限于分析。循环自由流液相等电聚焦以液体循环流动代替固相载体,上样量大,聚焦后样品分析处理方便,有较大的制造潜力。Bier等已开展这项技术的研究。该技术应用到遗传工程上可对干扰素等进行精制纯化。

线粒体呼吸链与活性氧

已知有氧真核生物细胞吸收的氧分子绝大部分都是在线粒体呼吸链末端细胞色素氧化酶上通过四步单电子还原生成水。但同时也有1%-2%的氧可在呼吸链中途接受单电子或双电子被部分还原生成超氧(O_2^-·)和过氧化氢(H_2O_2)作为呼吸作用的正常代谢产物。此种来源于线粒体呼吸链的O_2^-·和H_2O_2不但在多种病理的氧化损伤中起关键作用,同样它们也是正常生理条件下对多种细胞过程具有基本调控意义的氧还信号。基于Chance实验室约自20世纪70到90年代的早期研究贡献以及20世纪90年代后其他各实验室的研究新进展,我们聚焦于下述四个相关问题的评述和讨论:(1)由于线粒体内膜面积及其含有的呼吸链复合体酶活力远远高出细胞中所有膜系数量和相关酶活力之总和,因而线粒体呼吸链产生的O_2^-·和H_2O_2构成生物体内最大数量ROS的恒定来源;(2)线粒体呼吸链复合体Ⅲ的Q循环中Q_0位点中半醌自由基(UQH·)已明确是O_2^-·的单电子来源;还原细胞色素C-P66^(SHC)是生成H_2O_2的双电子供体。虽然复合体Ⅰ也是产生线粒体基质内O_2^-·的主要来源,但由于其确切生成位点尚未明确,在in vivo条件下能否产生大量O_2^-·也尚有争议;(3)线粒体呼吸链产生O_2^-·后的分配和跨膜转移涉及其生理病理作用机制和作用靶点等复杂而重要的问题,直到目前尚未意见一致。"质子和O_2^-·循环双回路解偶联模型"整合了目前提出的几种假说的联系点,指出H^+和O_2^-·相互作用生成HO_2·及其跨膜很可能是这一复杂问题的中心环节,并与O_2^-·对"脂肪酸shuttling model"或O_2^-·对"UCPS激活"模型形成了内在的联系;(4)线粒体呼吸形成的ΔP(ΔΨ和ΔpH)能直接控制呼吸链的ROS生成,并以非线性(非欧姆)相关方式通过影响Q循环中的Q_0半醌的氧还态和寿命来调节O_2^-·生成的急速变化,这一发现目前已获多家实验室的证实,业已成为线粒体学界的广泛共识。这样,线粒体呼吸生成的ΔP,除了在ATP合成和离子跨膜转运的经典的生物能量转换中介功能之外,又具有了调控作为细胞氧还信号分子ROS的新功能。线粒体也已不再单纯是细胞的"动力站",业已成为联结线粒体动态结构和功能变化与调节不同细胞事件的多细胞信号级联反应的整合平台。