功能性纳米自组装多肽KLPP凝胶修复软骨缺损的实验研究

目的探讨功能性纳米自组装多肽KLPP凝胶对关节软骨缺损的修复作用。方法培养人骨髓间充质干细胞(BMSCs),将BMSCs分为BMSCs-KLD-12组(BMSCs与KLD-12凝胶共培养)和BMSCs-KLPP组(BMSCs与KLPP凝胶共培养),分别行软骨诱导分化培养,MTT法检测细胞的增殖活性。将人软骨组织分为软骨-KLPP组(制作软骨缺损区并填充KLPP凝胶进行培养)、软骨-KLD-12组(制作软骨缺损区并填充KLD-12凝胶进行培养)、软骨组(仅制作软骨缺损区)。Calcein-AM/PI双染法检测BMSCsKLD-12组及BMSCs-KLPP组的细胞毒性。培养49 d后,收集软骨组、软骨-KLD-12组、软骨-KLPP组的软骨组织进行切片,并行阿尔新蓝染色。Western blot法检测各组中Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)、Ⅹ型胶原(Col-Ⅹ)的表达。结果与BMSCs-KLD-12组比较,BMSCs-KLPP组培养1 d、3 d、7 d的细胞增殖率均明显增加(P<0.05),且Col-Ⅰ、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ的相对表达水平明显增加(P<0.05)。Calcein-AM/PI双染色检测表明BMSCs-KLPP组和BMSCs-KLD-12组细胞活性基本一致,KLPP凝胶无细胞毒性。与软骨-KLD-12组比较,软骨-KLPP组软骨修复作用更明显(P<0.05),且Col-Ⅰ、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ的相对表达水平更高(P<0.05)。结论功能性纳米自组装多肽KLPP凝胶对关节软骨缺损具有良好的修复作用。

TGF-β_3诱导大鼠前软骨干细胞向软骨细胞特性方向分化及其在KLD-12自组装肽纳米凝胶中的培养

目的探讨软骨组织工程方法中修复软骨缺损理想的种子细胞和支架材料。方法免疫磁珠分离纯化新生大鼠前软骨干细胞(PSCs),分别采用KLD-12自组装肽纳米凝胶三维培养(实验组)和普通培养瓶平面培养(对照组),用转化生长因子β3(TGFβ-3)诱导两组PSCs向软骨细胞特性方向分化。利用RT-PCR、免疫组化等方法测定其向软骨细胞特性方向分化过程中特异性细胞外基质Ⅱ型胶原(collagenⅡ)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)表达的情况。结果RT-PCR和免疫组化检测结果表明KLD-12自组装肽纳米凝胶组细胞在诱导7、14 d后均有collagenⅡ和aggrecan表达,且RT-PCR检测结果表明KLD-12自组装肽凝胶组细胞的collagenⅡ和aggrecan mRNA表达水平较对照组高,其差异有统计学意义(均P<0.05)。结论TGFβ-3诱导后的PSCs可向成软骨方向分化,诱导后的PSCs与KLD-12自组装肽凝胶复合有望构建组织工程化软骨,KLD-12自组装肽纳米凝胶是较好的软骨组织工程细胞支架。

生长分化因子5基因转染大鼠脂肪干细胞在RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶中的培养

目的:将生长分化因子5(GDF-5)基因转染于大鼠脂肪干细胞并将其培养于RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶,并比较其与二维培养大鼠脂肪干细胞成软骨细胞分化效率。方法:选取雄性SD大鼠采用酶消化-密度梯度离心法提取脂肪干细胞行体外培养,并通过流式细胞术鉴定脂肪干细胞。采用LipofectamineTM2000进行脂质体pcDNA3.1(+)/GDF-5重组质粒瞬间转染大鼠脂肪干细胞。将转染大鼠脂肪干细胞分别置于三维RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶(实验组)及普通二维培养基培养(对照组)。通过RT-PCR、免疫组化及免疫荧光等方法检测培养1和2周后特异性细胞外基质Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ)和蛋白聚糖(Aggrecan)表达水平。结果:RT-PCR、免疫组化及免疫荧光检测结果表明RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶组细胞在诱导7d后有CollagenⅡ和Aggrecan表达,并且RT-PCR检测结果表明RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶组细胞的CollagenⅡ和Aggrecan mRNA表达水平较对照组高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:三维RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶有利于生长分化因子5转染脂肪干细胞Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达,促进生长分化因子5转染脂肪干细胞向成软骨细胞方向分化,RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶是较好的软骨组织工程细胞支架。

自组装多肽纳米凝胶支架三维培养前软骨干细胞的实验研究

目的构建新型自组装多肽纳米凝胶支架RGDmx,探讨支架的细胞相容性及其对前软骨干细胞(precartilaginous stem cells,PSCs)增殖和向软骨细胞方向分化的影响。方法取新生SD大鼠四肢长骨干骺端组织分离培养PSCs,采用免疫磁珠分选系统分选纯化原代细胞,并进行鉴定。取KLD-12、KLD-12-PRG多肽冻干粉,以体积比1∶1复合构建RGDmx。将纯化后的第3代PSCs接种至KLD-12(对照组)和RGDmx(实验组)培养,1、3、7、14 d用细胞计数(cell counting kit,CCK)-8法检测支架细胞增殖-毒性;制备不同混合比(0、20%、40%、60%、80%、100%)RGDmx,观察其对PSCs增殖的影响;采用无血清软骨形成培养液(complete chondrogenic medium,CCM)诱导两组支架内PSCs向软骨细胞方向分化,培养14 d时行甲苯胺蓝染色法鉴定,并用RT-PCR法检测两组软骨分化特异性基因Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达情况。结果成功分离纯化获得成纤维细胞生长因子受体3表达阳性细胞,免疫组织化学染色及免疫荧光染色鉴定为PSCs。CCK-8检测结果显示,复合培养后实验组细胞吸光度(A)值随培养时间延长逐步提高,7 d达峰值;其中7、14 d时细胞A值高于对照组(P<0.05);复合培养7 d时,混合比为40%组细胞A值较其他混合比组高,差异有统计学意义(P<0.05)。CCM诱导培养14 d时,两组支架内细胞甲苯胺蓝染色均呈阳性;RT-PCR检测示实验组细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论自组装多肽纳米凝胶支架RGDmx具有良好的细胞相容性,可有效促进PSCs增殖及向软骨细胞方向分化,是组织工程较理想的细胞载体系统。

装载黄芩苷的溶菌酶-低相对分子质量壳聚糖纳米凝胶的制备及表征

目的基于蛋白-多糖纳米凝胶的制备技术,通过低相对分子质量壳聚糖对溶菌酶的修饰以及对环境因素的调节筛选,控制溶菌酶的自组装行为,制备一种绿色环保的具备核壳结构的溶菌酶-低相对分子质量壳聚糖纳米凝胶,从而达到减小粒径,提高包封率和载药量的目的,使其更有利于肾靶向。方法利用Maillard反应将溶菌酶与低相对分子质量壳聚糖按不同比例合成溶菌酶-低相对分子质量壳聚糖枝接物,通过SDS-PAGE蛋白电泳来优选出产量最高的合成比例;对合成的产物进行内源荧光、紫外测定等表征,并通过2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzenesulfonic acid,TNBS)法测定接枝率;以粒径为评价指标,对溶菌酶浓度,反应体系pH值、加热温度等条件进行筛选优化,得到空白纳米凝胶最佳合成条件;选取适宜的载药方法,得到了载黄芩苷纳米凝胶。结果合成纳米凝胶的最佳工艺为溶菌酶与低相对分子质量壳聚糖比例1∶2、反应体系pH值11、溶菌酶-壳聚糖接枝物质量浓度为0.6 mg/mL、加热温度71℃、加热时间51 min。得到的溶菌酶-低相对分子质量壳聚糖枝接物接枝率为(24.7±2.9)%,空白纳米凝胶的粒径范围为16~120 nm、平均粒径为49.02 nm、PDI为0.132,载黄芩苷纳米凝胶的包封率为(95.00±2.54)%、载药量为(17.00±1.26)%。结论通过Maillard合成了溶菌酶-低相对分子质量壳聚糖纳米凝胶,并找到了最优的合成工艺。制备的纳米凝胶包封率高,粒径小,分布均匀,缓释效果明显。