家蚕抗菌肽基因的克隆及重组蛋白的自诱导表达

抗菌肽是生物体内具有抗菌活性的一种小分子物质,在昆虫细胞抵御外源微生物的感染过程中发挥着重要作用。为研究家蚕抗菌肽基因克隆、重组抗菌肽的表达和纯化方法,以家蚕中肠组织总RNA为模板,设计4对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增BmCecropin、BmCecropin B6、BmCecropin D和Bmmoricin这4种抗菌肽基因,通过自诱导方式原核表达4种抗菌肽重组蛋白,并对4种抗菌肽重组蛋白进行Ni-NTA亲和层析和超滤纯化。结果表明,克隆的BmCecropin、BmCecropin B6、BmCecropin D和Bmmoricin这4种抗菌肽的基因大小分别为198,108,105,129 bp,通过自诱导方式表达的BmCecropin、BmCecropin B6、BmCecropin D和Bmmoricin这4种抗菌肽重组蛋白,经SDS-PAGE电泳检测,大小分别为24,21,20,22 ku,经Ni-NTA亲和层析和超滤纯化后的4种抗菌肽重组蛋白条带单一。结果可为4种抗菌肽重组蛋白后续的抑菌试验和在抑菌剂、化妆品和防腐剂等方面的进一步应用奠定基础。

海藻糖合酶的自诱导表达及其催化生产海藻糖的新工艺

海藻糖合成酶一步合成法是制备海藻糖最具工业化前景的方法之一。在前期研究基础上,本研究从发酵产酶和酶催化两方面进一步降低海藻糖生产成本,提高生产效率。首先,采用自诱导表达系统,在摇瓶体系中对含有海藻糖合成酶的大肠杆菌BL21(DE3)进行三阶段温度控制发酵,即以自诱导培养基发酵培养重组大肠杆菌,在37℃培养2.5h,25℃培养10.5h,30℃继续培养至发酵终点;此时,酶活达到1.42×10~4U/mL,比自诱导恒温提高了57.4%。在此基础上,在5L反应器上进行三阶段温控发酵验证实验。通过连续发酵40h后OD达到31,细胞干重浓度达到15.32g/L,酶活达到最高值1.81×10~4U/mL,比摇瓶发酵提高了28.6%。其次,开展全细胞催化生产海藻糖工艺优化,以5%甲苯处理45min的大肠杆菌细胞为研究对象,考察了pH、反应温度、底物浓度对全细胞催化合成海藻糖的影响以及全细胞催化的重复使用性能。结果发现:催化反应在pH为7.5、温度为30℃、麦芽糖初始浓度为350g/L时,海藻糖的得率达到74%以上;全细胞催化反应10个批次后,细胞仍保持对麦芽糖64.1%的转化率。本研究为海藻糖的工业化生产提供了一种经济、高效的工艺路线。

金黄色葡萄球菌蛋白A在大肠杆菌中的自诱导表达以及单克隆抗体的制备

利用大肠杆菌表达金黄色葡萄球菌蛋白A,根据大肠杆菌密码子偏好性对金黄色葡萄球菌蛋白(SPA)基因进行密码子优化。SPA基因插入p ET28a表达载体中,利用自诱导培养基诱导SPA表达,表达量达8.2 mg/L。通过Ni亲和层析纯化SPA蛋白,纯度达到95%。纯化的SPA蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,抗体效价可达1∶40000,采用Protein G亲和层析纯化SPA单抗,纯度达98%。纯化后的SPA单抗检测与食品中常见的致病菌无交叉反应。结果显示,SPA单抗特异性良好,与其他致病菌无交叉反应。

维吉尼亚链霉菌P450-105D1在大肠杆菌中自诱导表达和雄烯二酮的羟化活性

雄烯二酮是甾体药物生产的重要中间体,其C9位羟基化产物9-羟基雄烯二酮也是多种重要甾体药物的合成前体,具有重要的临床药用价值。微生物转化生产9-羟基雄烯二酮具有重要的经济价值。将维吉尼亚链霉菌IBL14中svu005与pET28a质粒融合,导入大肠杆菌BL21(DE3)。使用优化的自诱导培养基诱导表达其产物细胞色素P450-105D1(CYP105D1)蛋白,以雄烯二酮等多种甾体作为底物进行微生物羟化。结果显示,构建的重组质粒pET28a-svu005在大肠杆菌中成功表达,使用ZYM培养基,自诱导表达的活性蛋白产量(0.0916nmol/L)显著高于传统的IPTG诱导方式的产量(0.0367nmol/L)。表达产物CYP105D1可以羟化雄烯二酮,经HPLC检测,产物为9-羟基雄烯二酮。发现了微生物转化合成9-羟基雄烯二酮的新途径,具有很好的工业应用前景。

破囊壶菌脂肪酶基因的克隆、双温控自诱导表达及酶学性质研究

【目的】克隆破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW7的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源高效表达,并进行初步酶学性质研究。【方法】基于转录组数据注释,获得脂肪酶基因lip,构建重组基因工程菌Rosetta(DE3)/p ET30-lip,利用双温控自诱导方法高效表达蛋白,表达产物(LIP)经Ni-Agarose His亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从Aurantiochytrium sp.PKU#SW7中克隆得到一个大小为873 bp的脂肪酶基因(Gen Bank登录号为KT305964),该酶对p-NPB最适反应温度和pH分别为40°C和8.0。以不同浓度的金属离子Ca^(2+)和Co^(2+)溶液分别保温处理酶液30 min可使酶活提高1.3倍左右;甲醇对脂肪酶的抑制作用不明显。在最适反应条件下对p-NPP与p-NPB的酶活力分别为70.0±3.1 U/mg和102.5±2.6 U/mg。【结论】Aurantiochytrium sp.PKU#SW7脂肪酶具有良好的特性,符合生物柴油生物催化剂基本要求。