弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物 ,采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段 ,克隆至 pMD18-T载体 ;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析 ;各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX - 4T - 2和真核表达载体 pVAX1,分别转化大肠杆菌BL2 1和JM10 9,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列 ;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达 ;将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠 ,观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段 ,各组阳性克隆的序列正确 ,并分别被亚克隆到原核表达质粒 pGEX - 4T - 2和真核表达载体pVAX1上 ,构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒 ;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白 ;真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论 以pGEX - 4T - 2和 pVAX1为载体 ,分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒。

编码弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)质粒DNA免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性(英文)

目的构建真核表达质粒pcGRA1,并观察其免疫小鼠的保护性。方法经PCR从cDNA克隆中扩增出GRA1编码基因,定向克隆入pcDNA3的EcoRⅠ/XhoⅠ位点,从而获得pcGRA1。用限制性内切酶消化、PCR及序列测定对该重组质粒进行鉴定。将100μg质粒于小鼠左后腿DNA肌注,于注射后2周和4周各加强1次;分别观察小鼠体内的特异性抗体滴度、GRA1基因在小鼠体内的分布、GRA1在肌细胞的表达以及免疫小鼠对弓形虫强毒株RH速殖子攻击后的保护性。结果DNA序列测定结果表明,将573bp的GRA1编码阅读框定向克隆到pcDNA3EcoRⅠ/XhoⅠ位点,成功构建了重组质粒pcGRA1;免疫小鼠血清中检测到特异性IgG;不同组织DNA为模板特异地扩增出GRA1编码基因;IFA检测pcGRA1免疫鼠肌细胞呈阳性反应;弓形虫RH株速殖子攻击感染pcGRA1免疫鼠,其存活时间长于对照组。结论重组质粒pcGRA1免疫小鼠可诱导特异性免疫反应,对弓形虫强毒株的攻击感染具有一定的保护性。

应用重组致密颗粒抗原6检测诊断弓形虫病的研究

目的以纯化的重组致密颗粒抗原6作为检测抗原,建立检测弓形虫IgM和IgG抗体的ELISA新方法,为临床治疗提供参考依据。方法 2007年1月-2011年12月对59份弓形虫阳性血清标本进行检测,并与进口弓形虫ELISA-IgM和IgG试剂盒进行比较,数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析。结果 ELISA法优化检测条件为包被抗原浓度为40μg/ml;敏感度比较表明血清稀释度在1∶10~1∶80为优;特异性试验表明IgM阳性的抑制率为97.36%、IgG阳性的抑制率为97.98%;用rGRA6-IgM-ELISA对混合弓形虫IgM阳性和阴性血清的精密度检测表明,IgM阳性的变异系数（CV值）为2.76%,IgM阴性混合血清的CV值为0.45%;用rGRA6-IgG-ELISA对混合弓形虫IgG阳性和阴性血清的精密度检测表明,IgG阳性的变异系数（CV值）为2.89%,IgG阴性混合血清的CV值为1.65%;rGRA6-IgM-ELISA与进口试剂盒的总符合率为91.01%,rGRA6-IgG-ELISA与进口试剂盒的总符合率为94.59%。结论重组抗原rGRA6能被弓形虫感染患者血清IgM和IgG抗体所识别,用重组抗原rGRA6构建的试剂盒诊断弓形虫病具有较高的特异性、敏感性。

弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅲ.pcDNA3-HBsAg-GRA1免疫小鼠的保护性观察

目的观察重组质粒pcDNA3HBsAgGRA1DNA接种诱导的保护性免疫应答。方法质粒DNA免疫BALB/c小鼠;ELISA法检测GRA1、HBsAg抗体及亚类水平;提取各免疫组小鼠肌肉组织DNA进行PCR检测;弓形虫RH强毒株攻击感染各免疫组小鼠。结果经pcDNA3HBsAgGRA1免疫组小鼠产生抗GRA1和HBsAg抗体,且抗GRA1的抗体水平明显高于GRA1单独和GRA1与HBsAg混合免疫组。弓形虫RH强毒株攻击感染pcDNA3HBsAgGRA1免疫组小鼠,其存活时间明显长于其他各组,结果提示HBsAg可能起免疫佐剂作用。结论将GRA1与HBsAg融合明显增强了GRA1的免疫原性和保护性。

弓形虫GRA1基因的体外扩增、克隆及鉴定

目的 体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA1基因 ,并构建真核表达质粒。方法 从接种了弓形虫RH株的小鼠腹水中收集、纯化速殖子 ,提取基因组DNA ;据已知的GRA1基因列 ,设计合成一对引物 ,并引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。应用PCR技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段。扩增目的基因片段经纯化、双酶切后 ,插入真核表达质粒pEGFP -N3中 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,于卡那霉素阳性LB平板上筛选阳性克隆。重组子经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、PCR鉴定。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出 785bp的GRA1基因片段 ,构建重组质粒pEGFPN3-GRA1,酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符。 结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了GRA1基因 ,并构建了pEGFPN3-GRA1重组质粒。

弓形虫GRA1基因变异及真核表达载体的构建

目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )基因真核表达质粒。方法 :根据 GRA1基因已知序列 ,设计一对引物。用 PCR技术从弓形虫 RH株基因组 DNA中扩增 GRA1基因片段 ,插入 pc DNA3质粒 ,转化大肠杆菌 DH5 α感受态细胞 ,经酶切及 PCR鉴定、测序。结果 :从弓形虫 RH株基因组中扩增出 775 bp的 GRA1基因 ,测序显示该基因存在一 1 35 bp的插入序列 ,使得所得 PCR产物分子量大于预期值 (6 2 8bp)。该插入序列造成GRA1基因移码突变。结论 :首次报道了变异的弓形虫 RH株

刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析

目的 克隆刚地弓形虫 RH株致密颗粒抗原 (Dense granule antigen,GRA6 )分子基因 ,为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础。 方法 根据己知的 GRA6序列合成一对引物 ,抽提弓形虫速殖子m RNA,以速殖子 m RNA为模板 ,通过反转录 PCR(RT- PCR)扩增出 GRA6的 c DNA条带。目的基因 DNA条带被克隆到质粒 p UC19中形成重组质粒。对重组质粒 DNA进行纯化 ,并对目的基因片段进行核苷酸序列分析。 结果 通过RT- PCR从 m RNA中扩增出一条分子量约 70 0 bp的 DNA条带。核苷酸序列分析表明 ,GRA6分子基因的开放的阅读框全长为 6 93bp,编码 2 30个氨基酸分子 ,与已报道的 RH株 GRA6分子具有 10 0 %的同源性。 结论 本研究获得了刚地弓形虫 RH株的 GRA6分子基因 。

弓形虫GRA7真核表达质粒的构建

目的:构建弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核重组表达质粒。方法:设计GRA7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。结果:PCR扩增出GRA7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-GRA8。结论:成功构建了GRA7的真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。