大黄泄浊颗粒保留灌肠对非透析慢性肾脏病肾性骨病湿热证患者骨密度及血清骨形成蛋白-7的影响

目的观察非透析慢性肾脏病（chronic kidney diseases，CKD）肾性骨病湿热证患者腰椎骨密度（bone mineral density，BMD）和血清骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）水平及大黄泄浊颗粒保留灌肠的干预作用。方法将64例非透析CKD3～5期湿热证患者随机分为治疗组和对照组各32例（结果每组失访2例），并设正常组20例。两组均给予基础治疗，治疗组加用大黄泄浊颗粒保留灌肠，每日1次，疗程均为8周。治疗前后分别观察两组血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），血清肌酐（serum creatinine，SCr）、钙（calcium，Ca）、磷（phosphorus，P）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、甲状旁腺激素（parathyroid hormone，iPTH）、BMP-7水平及第24腰椎BMD。结果治疗组临床疗效显著优于对照组（P〈0．05）。治疗4周末和8周末，两组中医证候积分均较前一时点显著降低（P〈0．05），且治疗组积分均显著低于对照组（P〈0．05）。治疗组在降低BUN、SCr和血清P、iPTH、ALP方面，以及在升高血清Ca和肾小球滤过率估算值方面均显著优于对照组（P〈0．05）。与正常组比较，CKD病例组BMD和BMP-7均显著降低（P〈0．05）；两组治疗后BMD和BMP-7均显著升高（P〈0．05），而治疗组BMD和BMP-7升高值均显著大于对照组（P〈0．05）。结论非透析CKD肾性骨病湿热证患者BMD和BMP-7水平均显著低于健康人群；大黄泄浊颗粒保留灌肠可防治非透析CKD肾性骨病，其机制可能与改善肾功能及升高血清BMP-7含量有关。

弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物,运用PCR方法扩增其基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)而构建重组表达质粒pcDNA3.1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞,RT-PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确,构建的重组表达质粒pcDNA3.1-GRA2经PCR、EcoRⅠ/HindⅢ双酶切和测序鉴定正确;转染GRA2基因的细胞,RT-PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-GRA2,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8截短型片段在原核中的表达

目的构建弓形虫GRA8原核重组表达质粒,分析其表达状况。方法采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列,经克隆后,亚克隆至原核表达载体中,构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒,分析GRA8的表达;将各重组菌进行诱导,将裂解上清用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化目的蛋白,免疫印迹法(Westernblotting)分析纯化蛋白的活性。结果GRA8基因被正确插入原核表达质粒中,原核重组表达质粒在大肠埃希菌JM109中表达GRA8的水平低,几乎无完整GRA8的表达,截短型GRA8经谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-PAGE获得纯化。纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别。结论GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低,纯化的截短型GRA8具一定的抗原反应性。

评价基于致密颗粒蛋白GRA1为抗原检测猫弓形虫感染的血清学诊断方法

为了研究以弓形虫致密颗粒蛋白GRA1为抗原检测猫弓形虫感染的血清学诊断及评价,试验采用标准弓形虫抗体阳性、阴性猫血清建立ELISA方法,最终确定重组GRA1最佳蛋白包被浓度为5μg/m L、血清最佳稀释度为1∶64,用此方法对已通过MAT/IFA法共同确定的185份猫弓形虫抗体血清进行检测并评价。结果表明:应用MAT/IFA法检出阳性血清39份、阴性血清146份,而通过重组GRA1-ELISA法检出阳性血清37份、阴性血清148份,二者共同检出阳性血清33份、阴性血清142份,GRA1假阳性率为10.8%,假阴性率为4.1%。比较重组GRA1-ELISA与MAT/IFA的结果,二者不一致部分无显著性差异(P>0.05);一致性部分经Kappa检验(K=0.83),一致率为94.6%。说明以重组GRA1作为包被抗原建立的ELISA方法检测效果没有弓形虫体裂解蛋白TLA好。因此,重组GRA1不是用于检测猫弓形虫感染的流行病学调查的最佳诊断抗原。

弓形虫致密颗粒蛋白的生物学功能及免疫原性研究的新进展

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)可引起严重的人兽共患弓形虫病,给全世界经济造成巨大的损失,给公共卫生安全带来巨大的隐患。致密颗粒(dense granule)分泌的致密颗粒蛋白(dense granule proteins,GRAs)参与调节纳虫泡(parasitophorous vacuole,PV)及纳虫泡膜(parasitophorous vacuole membrane,PVM)的形成并能维持其结构稳定性,部分GRAs可参与宿主细胞的转录。近几年来,不断发现了多种新的GRA蛋白家族新成员,并随着对该家族成员研究的逐步深入,发现GRAs是研制抗弓形虫疫苗的候选分子之一。本文综述了弓形虫致密颗粒蛋白的生物学功能和免疫原性研究的新进展,旨在为研究弓形虫致病机理和研发新的抗弓形虫疫苗提供思路。

积雪草颗粒对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞BMP-7表达的影响

目的观察积雪草颗粒(CAG)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞NRK52E骨形态发生蛋白-7(BMP-7)及TGF-β1表达的影响。方法将体外培养的NRK-52E分为正常对照组(N组)、TGF-β1刺激组(T组)和CAG小(C1组)、中(C2组)、大(C3组)及蒙诺组(M组)。细胞培养48 h后取出,采用RT-PCR技术和细胞免疫化学技术检测其BMP-7、TGF-β1 mRNA及蛋白。结果与N组比较,T组BMP-7 mRNA及蛋白的表达明显减少,TGF-β1 mRNA及蛋白的表达均明显增加(P<0.05);C2、C3、M组TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平均显著低于T组(P均<0.05),BMP-7 mRNA及蛋白表达水平均显著高于T组(P均<0.05);G3、M组BMP-7 mRNA及蛋白和TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平与N组比较,P均>0.05。结论CAG可通过直接抑制NRK52E中TGF-β1的表达并维持BMP-7的表达,而发挥抗肾间质纤维化的作用。

弓形虫致密颗粒蛋白基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的将克隆入pGEX-4T-1的致密颗粒蛋白基因进行表达并对表达产物的免疫反应性进行评价。方法将重组表达质粒pGEX-4T-1/GRA7转入大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导进行SDS变性蛋白质电泳,分别以Anti-GSTAntibody、免抗弓形虫阳性血清和人抗弓形虫阳性血清为一抗进行WesternBlot分析。用GSTrapFFHiTrapaffinitycolumns纯化重组蛋白,以此蛋白作为包被抗原,BLISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果SDS变性蛋白质电泳显示在43KDa～66KDa蛋白条带之间有特异蛋白的表达,蛋白分子量大小与理论值相符。WesternBlot分析表明该重组蛋白为GST融合蛋白,且该蛋白能被人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清所识别。ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫致密颗粒蛋白基因在大肠埃希菌中得到表达;该重组蛋白具有良好的免疫反应性。

弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达

目的 在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白(GRA7)。方法 将弓形虫GRA7基因克隆入原核表达载体p GEX- 4 T- 1,构建重组质粒p GEX- 4 T- 1/GRA7并转化大肠埃希菌BL2 1。IPTG体外诱导重组质粒菌的表达,对表达的GRA7融合蛋白进行SDS- PAGE和Western- blotting分析。结果 成功构建了p GEX- 4 T- 1/GRA7重组质粒,该重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,该蛋白能与抗GST抗体结合。结论 GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达。

弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白基因的序列分析及其在大肠埃希菌中的表达

目的分析弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白7(densegranuleprotein,GRA7)基因的异同及在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白。方法从弓形虫不同分离株(RH株、ZS2株和GT株)的基因组中特异地扩增出GRA7基因,将目的基因定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠埃希菌JM109并测序。利用互联网上的在线工具CLUSTALW进行序列分析。异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)体外诱导pGEX-4T-1/GRA7重组质粒菌的表达,对表达的目的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),分别以抗抗谷胱甘肽巯基转移酶(GST)抗体、人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Westernblotting分析。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,ELISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果弓形虫不同分离株GRA7的基因序列相同;pGEX-4T-1/GRA7重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,Westernblotting分析表明该蛋白为GST融合蛋白,且能被人抗弓形虫阳性血清所识别;ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫不同分离株GRA7基因具有高度保守性;GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达,且该重组蛋白具有一定免疫反应性。

弓形虫不同地理株致密颗粒蛋白基因的比较研究

目的 比较弓形虫不同地理株 (RH株、ZS2 株、GT株 )GRA7基因的异同。方法 从弓形虫不同地理株的基因组DNA中扩增出GRA7基因 ,对目的基因用限制性内切酶 (Esp3I、CfrI、MboI)酶切并比较。结果 PCR扩增出 3株弓形虫的目的基因片段大小均在 5 0 0bp - 75 0bp之间 ,约 711bp。三种限制性内切酶酶切片段的大小均与理论值相符。 结论 弓形虫不同地理株GRA7基因具有高度保守性。

清肾颗粒对湿热型慢性肾衰竭急剧加重患者肾功能及TGF-β_1和BMP-7的干预作用

目的:观察湿热型慢性肾衰竭(CRF)急剧加重患者血清转化生长因子-β1(TGF-β1)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)水平及清肾颗粒的干预作用。方法:64例湿热型CRF急剧加重患者随机分为治疗组33例和对照组31例,并选取20例健康体检者作为正常对照组。治疗组与对照组均在西药常规治疗同时使用黄苓解毒泄浊颗粒保留灌肠,治疗组加用清肾颗粒,每次1袋(10 g),每日3次口服,疗程8周。检测两组临床疗效及治疗前后血、尿TGF-β1及血BMP-7水平变化情况,并与正常对照组比较。结果:治疗组临床疾病总有效率为84.85%,优于对照组54.84%(P<0.05);治疗组中医证候总有效率为90.91%,明显高于对照组58.06%(P<0.01)。两组患者治疗前血、尿TGF-β1水平明显高于正常对照组(P<0.01),血BMP-7水平明显低于正常对照组(P<0.01);治疗后两组血、尿TGF-β1水平均下降(P<0.01或P<0.05),血BMP-7水平均升高(P<0.01或P<0.05),且治疗组优于对照组(P<0.05)。结论:湿热型CRF急剧加重患者血、尿TGF-β1水平较正常对照组明显升高,血BMP-7水平明显降低,清肾颗粒可显著降低血、尿TGF-β1水平,升高血BMP-7水平,改善肾功能,减轻临床症状。

弓形虫致密颗粒蛋白的免疫反应性评价

目的对弓形虫的重组蛋白谷胱甘肽巯基转移酶致密颗粒蛋白(GSTGRA7)的免疫反应性进行评价。方法异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠埃希菌BL21(pGEX4T1/GRA7)表达,表达产物进行十二烷基硫酸钠(SDS)变性蛋白质电泳,分别以人抗弓形虫阳性血清和兔抗弓形虫阳性血清为一抗进行WesternBlotting分析。用GST亲和层析柱纯化重组蛋白,以此蛋白作为包被抗原,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果重组蛋白GSTGRA7能被兔抗弓形虫阳性血清、人抗弓形虫阳性血清所识别。该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫重组蛋白GSTGRA7具有良好的免疫反应性。

尿毒清颗粒联合利拉鲁肽治疗糖尿病肾病的效果及对毒素清除情况、BMP-7、NF-κB的影响

目的探讨尿毒清颗粒联合利拉鲁肽治疗糖尿病肾病的效果及对毒素清除情况、骨形态发生蛋白7(BMP-7)、核因子-κB(NF-κB)的影响。方法选取2017年2月至2021年2月扶风县人民医院收治的糖尿病肾病患者100例作为研究对象,依据治疗方法将其分为尿毒清颗粒联合利拉鲁肽治疗组(联合治疗组)、单独利拉鲁肽治疗组(单独治疗组),各50例。分析两组患者的血糖代谢指标、肾功能指标、毒素清除情况、BMP-7、NF-κB、不良反应发生情况。结果治疗后,联合治疗组患者的空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(PBG)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)均低于单独治疗组(P<0.05);治疗后,联合治疗组的尿清蛋白排泄率(UAER)、尿素氮(BUN)均低于单独治疗组(P<0.05),胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)、Ccr高于单独治疗组(P<0.05);治疗后,联合治疗组的Scr、血磷、血尿酸、血尿素、β_(2)-微球蛋白(β_(2)-MG)、血清视黄醇结合蛋白(RBP)、甲状旁腺素(PTH)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)水平均低于单独治疗组(P<0.05)。治疗后,联合治疗组的BMP-7水平高于单独治疗组(P<0.05),NF-κB表达水平低于单独治疗组(P<0.05)。联合治疗组患者的不良反应发生率低于单独治疗组(P<0.05)。结论尿毒清颗粒联合利拉鲁肽治疗糖尿病肾病的效果较单独利拉鲁肽治疗好,更能有效清除毒素,提升BMP-7水平,降低NF-κB表达水平。

弓形虫GRA7基因的克隆表达及免疫分析

本文构建了刚地弓形虫RH株致密颗粒蛋白7（GRA7）基因原核表达重组质粒，进行蛋白表达并分析重组蛋白的免疫反应性。设计合成引物，从弓形虫RH株基因组DNA中特异扩增出GRA7基因片段并进行序列分析。目的片段用EcoRI和BamHI双酶切后分别构建重组质粒pET32a-GRA7和pET28a-GRA7，而后转人大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达，Westernblotting分析表达蛋白。结果显示，从弓形虫RH株中成功扩增出大小约710bp的GRA7基因片段，构建的重组质粒经双酶切和PCR鉴定及测序，目的基因片段与预期相符。重组质粒pET32a-GRA7经IPTG诱导后，可高效表达重组蛋白，Westernblotting分析显示重组GRA7蛋白能被弓形虫慢性感染血清识别，而重组质粒pET28a-GRA7未能诱导表达出目的蛋白。原核表达的重组GRA7抗原具有特异的免疫反应性，为弓形虫的诊断应用和疫苗研究奠定了基础。

FBW7通过促进NOX1降解抑制ox-LDL诱导的颗粒细胞凋亡

目的:探讨含F框及WD重复结构域蛋白7(F-box and WD repeat domain containing protein 7,FBW7)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipopretion,ox-LDL)诱导的颗粒细胞(granulosa cells,GCs)损伤的影响,并分析其机制。方法:收集从不同肥胖程度育龄期女性分离的GCs、从高脂饮食(high-fatty diet,HFD)喂养大鼠分离的GCs及ox-LDL处理的大鼠GCs,用Western blot法检测FBW7的表达。用编码FBW7的腺病毒载体(Ad-FBW7)感染大鼠GCs后,再用ox-LDL(80 mg/L)处理细胞48 h,分别用CCK-8法、Annexin V/PI染色法、光泽精化学发光法和Western blot法检测细胞活力、细胞凋亡、NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)活性和NOX关键亚基的蛋白表达。用环己酰亚胺(cycloheximide,CHX)追踪法评估过表达FBW7对NOX1降解的影响。结果:在肥胖育龄期女性的GCs、HFD喂养大鼠的GCs和ox-LDL处理的GCs中FBW7低表达(P<0.05)。过表达FBW7能抑制ox-LDL诱导的GCs损伤、NOX活性和NOX1表达(P<0.05)。CHX追踪法实验结果显示,在ox-LDL存在的条件下,过表达FBW7能加速NOX1的降解(P<0.05)。结论:过表达FBW7可通过加快NOX1降解而减弱NOX活性,从而减轻ox-LDL导致的GCs损伤。

miR-let-7b对卵泡颗粒细胞发育的作用

目的:目前为止,尚不清楚micro-RNA(miR)-let-7b是否通过MAP3K1调节卵泡颗粒细胞(FGCs)凋亡,本研究拟运用PCR和Western blotting方法对此进行实验验证.方法:应用CCK-8测定细胞存活率.设计合成miR-let-7b和MAP3K1 mRNA特异性引物,利用qRT-PCR和Western Blotting分析FGCs中miR-let-7b和MAP3K1 mRNA基因与蛋白的表达水平.结果:随着miR-let-7b模拟物剂量(40、60、80、100、120μM)的增加,FGC的增殖活性逐渐降低,MIM-4组的增殖活性明显低于CG和MIM-1组(P<0.05).miR-let-7b表达水平随着模拟物剂量的增加而逐渐降低,MIM-3和MIM-4组的miR-let-7b水平低于MIM-1(P<0.05或P<0.01).MIM-3和MIM-4组MAP3K1 mRNA和蛋白水平显著低于CG,而且MIM-4组MAP3K1 mRNA和蛋白水平低于MIM-1组(P<0.05).结论:miR-let-7b可明显降低FGC增殖活性.下调FGC中miR-let-7b mRNA表达水平,miR-let-7b处理可剂量依赖性地降低MAP3K1 mRNA和蛋白质表达水平.

槐杞黄颗粒对肝癌患者血清MMP-7表达的影响及疗效观察

目的观察肝癌患者口服槐杞黄颗粒治疗后其血清中基质金属蛋白酶7(MMP-7)水平的变化。方法90例肝癌患者随机分为常规治疗组和观察组,每组各45例,另选取健康者45例作为正常对照组。常规治疗组和观察组患者均行TACE介入治疗,未行放化疗或其他介入治疗,观察组在常规治疗的基础上加用槐杞黄颗粒。比较肝癌两组治疗前后患者的血清MMP-7水平,并进行随访及生存分析。结果治疗前,常规治疗组和观察组的血清MMP-7水平分别为(12.072±4.151)ng/ml和(11.679±4.253)ng/ml,明显高于正常对照组(1.856±0.772)ng/ml,差异均有统计学意义(t=13.465、14.003,P<0.001)。治疗后,观察组的血清MMP-7水平下降为(9.461±3.907)ng/ml,与治疗前、常规治疗组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。经随访,观察组肝癌患者的中位生存时间为16个月,对照组肝癌患者的中位生存时间为11个月,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。观察组患者的第1、2年的生存率分别为64.44%和44.83%,与常规治疗组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论槐杞黄颗粒可通过调节MMP-7的表达改善肝癌的预后,延长肝癌患者的生存时间。

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。

乳糖作为棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白表达诱导剂的可行性研究

乳糖不仅可以诱导棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白表达,而且表达量与IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂时相比,并不低于后者,这样大规模生产棉龄虫颗粒体病毒增效蛋白的成本就可能被降低.乳糖的最适浓度经优化为2.2%～2.5%(W/V).对乳糖的不同除菌处理表明:0.70×105Pa 15min蒸汽灭菌的乳糖可以诱导此增效蛋白表达,这种处理比滤膜过滤除菌更为方便和经济,因此就为棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白的生产提供了经济实用的前景.

弓形虫致密颗粒蛋白GRA7的全基因原核重组表达

目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白7(GRA7)的全长基因,在大肠杆菌工程菌中重组表达GST-His-GRA7融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA7基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,最后采用SDS-PAGE和West ern blotting鉴定重组蛋白产物。结果构建了弓形虫GRA7全基因的重组表达质粒,诱导表达了GST-His-GRA7融合重组蛋白,分子量为62kD,与预测结果相符。结论研究获得了弓形虫GRA7全基因的重组蛋白,为进一步研究弓形虫GRA7抗原性及其与宿主细胞的相互作用奠定了基础。