弓形虫致密颗粒蛋白GRA7的全基因原核重组表达

目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白7(GRA7)的全长基因,在大肠杆菌工程菌中重组表达GST-His-GRA7融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA7基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,最后采用SDS-PAGE和West ern blotting鉴定重组蛋白产物。结果构建了弓形虫GRA7全基因的重组表达质粒,诱导表达了GST-His-GRA7融合重组蛋白,分子量为62kD,与预测结果相符。结论研究获得了弓形虫GRA7全基因的重组蛋白,为进一步研究弓形虫GRA7抗原性及其与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。

弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物,运用PCR方法扩增其基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)而构建重组表达质粒pcDNA3.1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞,RT-PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确,构建的重组表达质粒pcDNA3.1-GRA2经PCR、EcoRⅠ/HindⅢ双酶切和测序鉴定正确;转染GRA2基因的细胞,RT-PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-GRA2,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8截短型片段在原核中的表达

目的构建弓形虫GRA8原核重组表达质粒,分析其表达状况。方法采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列,经克隆后,亚克隆至原核表达载体中,构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒,分析GRA8的表达;将各重组菌进行诱导,将裂解上清用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化目的蛋白,免疫印迹法(Westernblotting)分析纯化蛋白的活性。结果GRA8基因被正确插入原核表达质粒中,原核重组表达质粒在大肠埃希菌JM109中表达GRA8的水平低,几乎无完整GRA8的表达,截短型GRA8经谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-PAGE获得纯化。纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别。结论GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低,纯化的截短型GRA8具一定的抗原反应性。

评价基于致密颗粒蛋白GRA1为抗原检测猫弓形虫感染的血清学诊断方法

为了研究以弓形虫致密颗粒蛋白GRA1为抗原检测猫弓形虫感染的血清学诊断及评价,试验采用标准弓形虫抗体阳性、阴性猫血清建立ELISA方法,最终确定重组GRA1最佳蛋白包被浓度为5μg/m L、血清最佳稀释度为1∶64,用此方法对已通过MAT/IFA法共同确定的185份猫弓形虫抗体血清进行检测并评价。结果表明:应用MAT/IFA法检出阳性血清39份、阴性血清146份,而通过重组GRA1-ELISA法检出阳性血清37份、阴性血清148份,二者共同检出阳性血清33份、阴性血清142份,GRA1假阳性率为10.8%,假阴性率为4.1%。比较重组GRA1-ELISA与MAT/IFA的结果,二者不一致部分无显著性差异(P>0.05);一致性部分经Kappa检验(K=0.83),一致率为94.6%。说明以重组GRA1作为包被抗原建立的ELISA方法检测效果没有弓形虫体裂解蛋白TLA好。因此,重组GRA1不是用于检测猫弓形虫感染的流行病学调查的最佳诊断抗原。

弓形虫致密颗粒蛋白的生物学功能及免疫原性研究的新进展

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)可引起严重的人兽共患弓形虫病,给全世界经济造成巨大的损失,给公共卫生安全带来巨大的隐患。致密颗粒(dense granule)分泌的致密颗粒蛋白(dense granule proteins,GRAs)参与调节纳虫泡(parasitophorous vacuole,PV)及纳虫泡膜(parasitophorous vacuole membrane,PVM)的形成并能维持其结构稳定性,部分GRAs可参与宿主细胞的转录。近几年来,不断发现了多种新的GRA蛋白家族新成员,并随着对该家族成员研究的逐步深入,发现GRAs是研制抗弓形虫疫苗的候选分子之一。本文综述了弓形虫致密颗粒蛋白的生物学功能和免疫原性研究的新进展,旨在为研究弓形虫致病机理和研发新的抗弓形虫疫苗提供思路。

弓形虫致密颗粒蛋白基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的将克隆入pGEX-4T-1的致密颗粒蛋白基因进行表达并对表达产物的免疫反应性进行评价。方法将重组表达质粒pGEX-4T-1/GRA7转入大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导进行SDS变性蛋白质电泳,分别以Anti-GSTAntibody、免抗弓形虫阳性血清和人抗弓形虫阳性血清为一抗进行WesternBlot分析。用GSTrapFFHiTrapaffinitycolumns纯化重组蛋白,以此蛋白作为包被抗原,BLISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果SDS变性蛋白质电泳显示在43KDa～66KDa蛋白条带之间有特异蛋白的表达,蛋白分子量大小与理论值相符。WesternBlot分析表明该重组蛋白为GST融合蛋白,且该蛋白能被人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清所识别。ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫致密颗粒蛋白基因在大肠埃希菌中得到表达;该重组蛋白具有良好的免疫反应性。

弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白基因的序列分析及其在大肠埃希菌中的表达

目的分析弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白7(densegranuleprotein,GRA7)基因的异同及在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白。方法从弓形虫不同分离株(RH株、ZS2株和GT株)的基因组中特异地扩增出GRA7基因,将目的基因定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠埃希菌JM109并测序。利用互联网上的在线工具CLUSTALW进行序列分析。异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)体外诱导pGEX-4T-1/GRA7重组质粒菌的表达,对表达的目的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),分别以抗抗谷胱甘肽巯基转移酶(GST)抗体、人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Westernblotting分析。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,ELISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果弓形虫不同分离株GRA7的基因序列相同;pGEX-4T-1/GRA7重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,Westernblotting分析表明该蛋白为GST融合蛋白,且能被人抗弓形虫阳性血清所识别;ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫不同分离株GRA7基因具有高度保守性;GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达,且该重组蛋白具有一定免疫反应性。

弓形虫不同地理株致密颗粒蛋白基因的比较研究

目的 比较弓形虫不同地理株 (RH株、ZS2 株、GT株 )GRA7基因的异同。方法 从弓形虫不同地理株的基因组DNA中扩增出GRA7基因 ,对目的基因用限制性内切酶 (Esp3I、CfrI、MboI)酶切并比较。结果 PCR扩增出 3株弓形虫的目的基因片段大小均在 5 0 0bp - 75 0bp之间 ,约 711bp。三种限制性内切酶酶切片段的大小均与理论值相符。 结论 弓形虫不同地理株GRA7基因具有高度保守性。

弓形虫致密颗粒蛋白的免疫反应性评价

目的对弓形虫的重组蛋白谷胱甘肽巯基转移酶致密颗粒蛋白(GSTGRA7)的免疫反应性进行评价。方法异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠埃希菌BL21(pGEX4T1/GRA7)表达,表达产物进行十二烷基硫酸钠(SDS)变性蛋白质电泳,分别以人抗弓形虫阳性血清和兔抗弓形虫阳性血清为一抗进行WesternBlotting分析。用GST亲和层析柱纯化重组蛋白,以此蛋白作为包被抗原,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果重组蛋白GSTGRA7能被兔抗弓形虫阳性血清、人抗弓形虫阳性血清所识别。该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫重组蛋白GSTGRA7具有良好的免疫反应性。

弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达

目的 在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白(GRA7)。方法 将弓形虫GRA7基因克隆入原核表达载体p GEX- 4 T- 1,构建重组质粒p GEX- 4 T- 1/GRA7并转化大肠埃希菌BL2 1。IPTG体外诱导重组质粒菌的表达,对表达的GRA7融合蛋白进行SDS- PAGE和Western- blotting分析。结果 成功构建了p GEX- 4 T- 1/GRA7重组质粒,该重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,该蛋白能与抗GST抗体结合。结论 GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达。

重组GRA5蛋白免疫诊断弓形虫病价值的研究

目的原核表达的刚地弓形虫致密颗粒蛋白5(rGRA5)免疫诊断价值的探讨。方法 GRA5基因在RTPCR被扩增,构建pET28a-GRA5原核表达载体,双核酸内酶切及序列测定进行鉴定,pET28a-GRA5IPTG诱导表达后,SDS-PAGE和Western blot法检测该重组蛋白的表达。建立以纯化的重组蛋白的间接ELISA法,检测收集样本血清中弓形虫特异性抗体。结果 PCR反应扩增出为363 bp大小的GRA5基因,所构建的pET28a-GRA5原核表达载体经双酶切显示插入片段大小与上相符,DNA测序结果表明与Gen Bank中录入的GRA5基因经Blast比对序列同源性100%,原核细胞表达的该重组蛋白在SDS-PAGE和Western blot中均有显示(约14 ku)。本实验建立的ELISA法检测的100例弓形虫感染者(血清学阳性)血清中有73例呈阳性,阳性率为73.0%(73/100),其中40例IgG阳性标本的阳性率为72.5%(29/40),30例IgM阳性标本的阳性率为53.3%(16/30),30例IgG、IgM均阳性标本的阳性率为93.3%(28/30),30例阴性血清标本的阳性率仅为6.7%(2/30)。结论本实验获得的原核表达的rGRA5具有一定的弓形虫病免疫诊断的潜在价值。

弓形虫GRA7基因的克隆表达及免疫分析

本文构建了刚地弓形虫RH株致密颗粒蛋白7（GRA7）基因原核表达重组质粒，进行蛋白表达并分析重组蛋白的免疫反应性。设计合成引物，从弓形虫RH株基因组DNA中特异扩增出GRA7基因片段并进行序列分析。目的片段用EcoRI和BamHI双酶切后分别构建重组质粒pET32a-GRA7和pET28a-GRA7，而后转人大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达，Westernblotting分析表达蛋白。结果显示，从弓形虫RH株中成功扩增出大小约710bp的GRA7基因片段，构建的重组质粒经双酶切和PCR鉴定及测序，目的基因片段与预期相符。重组质粒pET32a-GRA7经IPTG诱导后，可高效表达重组蛋白，Westernblotting分析显示重组GRA7蛋白能被弓形虫慢性感染血清识别，而重组质粒pET28a-GRA7未能诱导表达出目的蛋白。原核表达的重组GRA7抗原具有特异的免疫反应性，为弓形虫的诊断应用和疫苗研究奠定了基础。

重组刚地弓形虫GRA10蛋白的表达纯化与鉴定

为构建表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)致密颗粒蛋白10(dense granule protein 10,GRA10)N端(AA 4-478)的重组质粒并在大肠杆菌中表达纯化该重组蛋白,以用于后续的诊断检测试剂盒设计。根据GRA10的基因序列设计并合成特异性引物,通过PCR方法从弓形虫ME49虫株cDNA中扩增GRA10(AA 4-487)的编码片段,利用同源重组的方法将其连接到pE-SUMO载体上。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)后并用IPTG诱导SUMO-GRA10的表达,产物通过SDS-PAGE分析并用亲和层析方法纯化,然后采用Western blot分析其免疫反应性。结果表明,已成功构建了表达弓形虫GRA10蛋白的重组质粒并利用原核表达系统表达纯化了具有良好免疫反应性的蛋白,为弓形虫病诊断奠定了基础。

弓形虫GRA4和SAG2基因重组BCG疫苗免疫保护性的比较研究

目的比较弓形虫致密颗粒蛋白4(GRA4)基因和表面抗原2(SAG2)基因的重组卡介苗(BCG)对小鼠的免疫保护效果。方法108只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分成6组:PBS组、BCG空白菌组、BCG-空白载体组、BCG-SAG2组、BCG-GRA4组和BCG-SAG2+GRA4组,每组18只。每鼠分别注射对应液体/疫苗100μl,共2次,间隔2周。接种前尾静脉采血,接种后4、6、8周每组分别剖杀3只,取脾和眼眶血检测细胞因子、IgG与IgM抗体,T淋巴细胞亚群计数,淋巴细胞转化率等。末次免疫后3周,每组剩余小鼠分别腹腔接种RH株弓形虫速殖子50个进行攻击感染,观察各组小鼠存活时间。结果弓形虫SAG2和GRA4重组BCG疫苗均能诱导小鼠产生免疫应答。第4周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值最高,为14.06%±1.17%。第6周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的IgG抗体水平最高,为0.18±0.02。第8周时,BCG-SAG2免疫组小鼠的IgM抗体水平最高,为0.82±0.05;弓形虫速殖子攻击后,BCG-SAG2组平均存活8.61d,PBS对照组平均存活7.33d,3个免疫组小鼠比其他3组的平均存活时间长1d。结论弓形虫重组BCG疫苗具有一定的免疫保护性。

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA2全基因的原核重组表达

目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白2(GRA2)的全长基因,在大肠埃希菌工程菌中重组表达GST-HisGRA2融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA2基因全长,与pET-41Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠埃希菌RosettaTM(DE3)pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,然后采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白产物。结果 PCR鉴定弓形虫GRA2全基因重组表达质粒构建正确;诱导表达的GSTHis-GRA2融合重组蛋白分子质量单位为52ku,与预测值相符。结论本研究成功构建了弓形虫GRA2全基因重组蛋白质粒,该质粒能表达GRA2蛋白,为研究GRA2与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。

重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。

弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒。方法设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAC而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况。结果PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达。结论成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8。

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核重组表达质粒的体外表达分析

目的:分析弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核表达质粒的体外表达。方法:大量提取纯化重组真核表达质粒pVAX1-GRA8,瞬时转染培养的vero E-6细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测GRA8在细胞中的表达。结果:从转染pVAX1-GRA8后的vero E-6细胞的RNA中扩增出GRA8的特异条带,转染细胞存在弓形虫感染血清识别的特异蛋白质条带。结论:真核表达质粒pVAX1-GRA8在vero E6细胞中获得表达。