不同方法检测食品中大肠埃希氏菌O157:H7/HM能力验证结果比较与分析

为提高实验室对食品中大肠埃希氏菌O157∶H7的检验检测能力,笔者单位参加了由中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的食品中大肠埃希氏菌O157∶H7检测能力验证计划。此次实验采用国家标准《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157∶H7/NM检验》(GB 4789.36—2016)中的第一法和实时荧光PCR方法,分别对能力验证样品进行检测。结果显示,样品23-G520中未检出大肠埃希氏菌O157∶H7;样品23-F568中检出大肠埃希氏菌O157∶H7,结果反馈为满意。在能力验证实验中,不同检测方法同时使用、综合判断,能有效提高检测能力和结果的准确性。

大肠埃希氏菌O157和O111能力验证样品的研制

目的研制植物源性成分绿豆基质中O157和O111检测能力验证样品,建立有效的样品制备流程来考核实验室检测致泻大肠埃希氏菌O157和O111的能力,根据参加实验室检测结果是否准确及可靠来评价实验室检测水平,并促进实验室检测体系进一步完善。方法选用O157和O111的ATCC标准菌株制备样品,以绿豆粉为基质,真空冷冻干燥技术制备样品。采用显色培养基、荧光定量PCR、全自动细菌生化鉴定仪、VIDAS全自动免疫荧光分析仪和血清型鉴定进行定性检测,并进行菌落计数。结果随机选取每一批阳性样品中的30个样品,每个样品中目标菌数在21~60 CFU之间,并且A组与B组阳性样品中均检测出目标菌,而阴性样品中均没有出现目标菌。结论表明采用本方法制备的能力验证样品均一稳定,能较好地评价实验室致泻大肠埃希氏菌O157和O111的检测能力。

基于内参的大肠埃希氏菌O157∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

针对大肠埃希氏菌O157∶H7 rfb E和Flic靶基因保守序列,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并加入内参(internal amplification control,IAC),建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应(polymease chain reaction,PCR)检测方法。结果表明,该方法对E.coli O157∶H7基因组DNA的最低检测限为1 pg/μL;对含有靶基因质粒的最低检测限为103 copies/μL;对细菌的最低检测限为5×103 CFM/m L;Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(R2=0.999)。人工污染实验结果表明,在初始菌量为7 CFM/25 g时,采用水洗加试剂盒法提取DNA,E.coli O157∶H7在增菌6 h后即可检出;而采用水煮法提取DNA,则在增菌10 h后方可检出。建立的E.coli O157∶H7实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中O157∶H7,又能实时监测PCR反应过程,有效防止"假阴性"的发生。

大肠埃希氏菌O157:H7的HDA检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测体系,建立HDA检测方法对大肠埃希氏菌O157:H7进行检测。采用大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测大肠埃希氏菌O157:H7的HDA检测法,进行了特异性和灵敏度试验,并与普通PCR方法进行了比较。结果表明:所建立起的检测法,灵敏度为4.3×103 cfu·mL-1,灵敏度与普通PCR方法相当。大肠埃希氏菌O157:H7的依赖解旋酶DNA恒温扩增检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。具有广阔的推广前景。

河南省6类食品中肠出血性大肠埃希氏菌O_(157)∶H_7污染状况调查

调查肠出血性大肠埃希氏菌O1 57∶H7在河南省 6类食品中的分布特征和污染状况 ,了解季节因素对于肠出血性大肠埃希氏菌O1 57∶H7分布的影响 ,以预防和控制食品污染保证食品安全。依据河南省自然地理概况 ,分 5个采样区域 ,按夏季和冬季在销售环节随机抽取样品 ,选择性增菌培养后 ,用O1 57胶体金试剂筛查 ,免疫磁珠富集后分离病原菌 ,应用bioM啨ｒｉｅｕｘＶＩＴＥＫ32AMSsystem ,GNI+ 和血清学的方法进行鉴定。结果显示 14 6 3份食品中共检出肠出血性大肠埃希氏菌O1 57∶H72 8株 ,检出率为 1 9% ,其中鲜肉和生食蔬菜检出率最高 ,为 3 3%和 3 2 % ,酸奶中未检出。夏季检出率 (2 5 % )明显高于冬季检出率 (1 1% )。结果提示 ,肠出血性大肠埃希氏菌O1 57∶H7在食品中的污染程度较为严重 ,其检出率的高低与O1 57∶H7感染性腹泻的流行强度呈正相关。应引起有关部门的足够重视 ,加强畜禽屠宰、蔬菜生产和销售环节的监督和监测 。

动物性食品中大肠埃希氏菌O157∶H7特异性二重PCR检测方法的建立

根据大肠埃希氏菌O157∶H7 wzx和fliC基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠埃希氏菌O157∶H7的二重PCR体系,扩增产物为395bp(wzx)和1057bp(fliC).人工培养基中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限为2.3×102CFU/mL,人工污染的牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限分别为5.8×102CFU/mL、4.3×102CFU/g和3.1×103CFU/g.样品经3h预增菌后检测下限可达3.1×100～5.8×100CFU/mL(或CFU/g).试验结果提示,针对wzx及fliC基因的二重PCR方法可以快速特异地检测出牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的污染.

呼和浩特市食品中大肠埃希氏菌O157:H7污染状况调查

目的本次研究旨在通过对呼市居民主要的消费食品进行大肠埃希氏菌O157:H7的污染调查,从而掌握该菌对食品的污染情况。方法随机抽取超市、农贸市场、酒店、食品店出售的食品共计15种307份,采用国标法进行检测。结果 349份食品中,检测出2株大肠埃希氏菌O157:H7,检出率为0.57%。其中生畜肉检出1株,检出率1.32%;米粉、盒饭类食品检出1株,检出率3.57%;其余食品均未检出。结论生畜肉,米粉、盒饭类食品中均检出大肠埃希氏菌O157:H7。提示存在发生食源性大肠埃希氏菌O157:H7病的潜在危险。

大肠埃希氏菌O157∶H7三种标准中的检测方法比较

在进行大肠埃希氏菌O157∶H7扩项过程中,对国内常用3个标准中的常规培养法进行比较分析。结果表明,不同温度培养的增菌肉汤均浑浊生长。大肠埃希氏菌O157∶H7显色培养基选择性较好,建议在日常检测工作中使用大肠埃希氏菌O157∶H7显色培养基,以提高区分度及检出率。同时,应用VITEK 2可以快速简便地鉴别目标菌。

大肠埃希氏菌O157∶H7/NM标准物质制备

本文用冷冻干燥法制备含鸡肉基质的大肠埃希氏菌O157∶H7/NM标准物质,以细菌存活率为指标,选择存活率最高的保护剂配方。以经钴-60辐照灭菌的鸡肉粉(无抗生素)作为基质,按适当的比例与保护剂配方液混合,添加菌液,于-70℃速冻20 h后冷冻干燥,对样品进行均匀性检测、稳定性追踪以及建立不确定度评估。结果显示,保护剂最优配方为10%海藻糖+25%脱脂牛奶+4%聚乙烯吡咯烷酮+0.8%甘氨酸;基质液比例为基质∶水=1∶7。按基质液:保护剂配方液=1∶3制备样品,均匀性试验:F统计量=1.197<2.201,均匀性良好。当测量检验结果用2次测量值平均值表示结果时,其值分布区间为±80 CFU/mL,且在-20℃的温度下保存18个月未观测到不稳定性。

国内外致泻大肠埃希氏菌O157:H7的检测标准比较及建议

致泻大肠埃希氏菌O157:H7(STEC O157:H7)是大肠埃希氏菌中致病性最严重的一种食源性致病菌,主要存在于牛肉、牛奶、水果及其制品中,对身体健康造成很大危害,甚至引发死亡。食品中STEC O157:H7检测尤为重要。本文对国内外STEC O157:H7的检测标准进行比较,提出我国标准在样品前处理、快速筛选方法的应用等方面需要加强,以便为该菌快速准确检测提供帮助,实现与国际标准化体系建设接轨,满足实验室检测需要。

1株不分解乳糖O111:K58型致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定

目的:探讨一起疫情中的致病性大肠埃希氏菌(EPEC)O111:K58的分离鉴定。方法:依据GB/T4789.6-2003《食品卫生微生物学检验,致泻大肠埃希氏菌检验》对致病性大肠埃希氏菌(EPEC)O111:K58进行培养,经染色镜检,生化反应,血清学试验,噬菌体裂解试验作出鉴定。结果:从患者粪便接种的庆大平板中检出1株不分解乳糖致病性大肠埃希氏菌(EPEC)O111:K58。结论:抗菌素合适量的庆大平板可用以分离到致病性大肠埃希氏菌。

级联信号转导系统结合免疫层析法检测大肠埃希氏菌O157:H7

首先通过免疫磁技术实现目标菌的有效富集,然后经同时标记了大量抗体与β-内酰胺酶的胶体金纳米探针介导,利用β-内酰胺酶高效水解青霉素实现检测信号转导及放大,再通过免疫层析法对青霉素含量变化的灵敏甄别,最终实现大肠埃希氏菌O157:H7的超灵敏检测。建立的检测方法对大肠埃希氏菌O157:H7的检测灵敏度为2×10^(2) CFU/mL,相比传统的免疫层析法检测灵敏度提高了570倍。实现超灵敏检测食源性致病菌的同时规避了双抗夹心免疫层析法中Hook效应的影响,为免疫层析高灵敏准确检测大分子目标物提供了新的思路。

实时荧光重组酶聚合酶扩增检测大肠埃希氏菌O157

目的建立实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测大肠埃希氏菌O157的分析方法。方法根据大肠埃希氏菌O157的rfbE基因(S83460.1),设计特异性引物和exo探针,分别进行引物探针筛选和特异性、灵敏度以及稳定性探究,并对人工污染样品和实际样品进行检测,验证本研究方法的实用性。结果本方法在37℃恒温20 min内可完成对大肠埃希氏菌O157的定性检测,目的DNA的检测限为0.01ng/μL,目的菌的检测限为10~3CFU/mL。在稳定性实验中,选择从100~0.001 ng/μL的10倍梯度稀释的目的DNA进行每个浓度8个平行的测试,0.01 ng/μL及以上浓度的DNA的8个平行均可稳定检出。对于大肠埃希氏菌O157的初始污染量为4 CFU/25 g的牛奶和鸡肉人工污染样品,增菌9 h后,可检出其中的目的菌。用本方法和国标方法GB 4789.36-2016同时检测20份实际样品,结果一致。结论该方法快速、简便,可作为一种常温下大肠埃希氏菌O157的快速检测手段,应用于基层实验室或现场检测。

三重荧光PCR检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7

目的建立一种检验沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7的TaqMan探针三重荧光PCR方法。方法针对沙门氏菌属特异性invA基因、金黄色葡萄球菌rpoB基因、大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因设计引物与探针,建立三重荧光PCR体系,对引物与探针浓度及退火温度优化,并进行特异性和敏感性研究。结果引物与探针的最优添加量为:invA 0.2μL、ropB 0.4μL、rfbE 0.5μL;最优退火温度为60℃。特异性试验显示16株非目标菌株扩增结果为阴性;目标菌株均出现显著扩增。敏感性试验显示,3种微生物对应的最低菌体数量检出量依次为:230、38、670 CFU。结论该方法特异性好、灵敏度高,能够快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7。