基于体温扩增的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种3种可视化快速检测方法的建立

为实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)的快速检测,基于体温扩增技术——酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA),并根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种bonM基因序列设计和筛选了ERA检测引物和探针,分别建立ERA显色法、荧光法、试纸条法3种可视化快速检测方法,并评估其特异性和灵敏度,以及在市售样品检测适用性和准确性。结果显示,建立的方法对3株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均有扩增,其他常见的食源性致病菌以及其他唐菖蒲伯克霍尔德氏菌均无扩增,说明检测方法的特异性良好。3种方法的检出限均为10^(-2)ng/μL,灵敏度较好。采用建立的3种可视化快速检测方法对15份市售样品进行检测,检出阳性2份,检出率为13.3%。该结果与国标方法的检测结果一致,说明方法具有较好的适用性和准确性。本研究建立的基于体温扩增技术的显色法、荧光法和试纸条法具有较高的特异性及灵敏度,37℃体温扩增15 min左右即可获取检测结果,且裸眼可视,可为食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种的现场可视化快速筛查提供新型简便的策略。

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的遗传多样性及进化关系

猕猴桃细菌性溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性病害,在世界各大猕猴桃产区发病严重。引起该病的病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae,Psa)。综合当前国内外关于该病原菌的相关研究,就其分类地位、遗传多样性及起源进化等方面进行了系统综述。

水稻黄单胞菌水稻致病变种的超氧化物歧化酶活性及诱导

以水稻黄单胞菌水稻致病变种 (Xanthomonasoryzaepv .oryzae)的毒性菌株PXO99A和无毒菌株PXO99A(pBUavrXa1 0 F1 ) ,检测液体培养中菌体超氧化物歧化酶 (SOD)活性变化 ,以说明SOD与菌株致病性的关系。结果表明 ,菌体SOD活性高峰出现于延迟期末 ,之后下降 ;毒性菌株SOD活性高于无毒菌株。两个菌株的SOD活性的胞内定位均以胞质为主 ,占总活性的 70 %以上 ;酶体周质中SOD活性占总活性的 2 0 %～ 30 %。以 50～ 80 0 μmol/L外源O-2 处理细菌培养物 1h ,可诱导菌体中SOD活性的增加。其中以 2 0 0 μmol/LO-2 处理SOD活性最高 ;1 2h菌龄培养物的诱导效果优于 2 4h培养物 ;对毒性菌株SOD的诱导作用更为明显。外源O-2 处理后细菌存活率明显降低 ,2 4h培养物的存活率下降大于 1 2h培养物 ;毒性菌株存活率下降大于无毒菌株。

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关

在以前的工作中 ,采用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xcc) 80 0 4菌株进行诱变 ,获得一批胞外多糖 (EPS)合成减少的突变体 ,对这些突变体的Tn5gusA5的插入位点进行分析后 ,发现有两株突变体是wxcA基因不同插入位点的突变体。以前认为wxcA基因与脂多糖 (LPS)的O 抗原合成有关而与EPS的合成无关。为明确wxcA基因的功能 ,对 80 0 4菌株的wxcA基因进行缺失 ,获得的ΔwxcA突变体的EPS产量与野生型菌株相比 ,减少了 5 0 % ,并且一段PCR合成的包含wxcA基因的DNA片段能反式互补ΔwxcA突变体 ,恢复突变体的EPS产量。这证实了 80 0

落葵上发现短小杆菌属(Curtobacterium)一个新的致病变种

1994年在江苏省南京及镇江地区新发现了落葵细菌性叶斑病 ,从病斑所分离的 10个细菌菌株经柯赫氏法则验证 ,均确系该病的病原菌。采用形态观察、表型特征和生理生化特性测定、数值分析、血清学反应、细胞化学成分分析和 DNA G+C mol%测定进行了鉴定 ,并与植物病原棒形细菌 15个标准菌株进行了比较。该病原菌为革兰氏阳性细菌 ,不规则短杆状 ,有一根鞭毛 ,亚极生或侧生 ,结合其生理生化特性、细胞化学成分和 DNA G+C mol%测定结果 ,认为应属于短小杆菌属( Curtobacterium)的萎蔫短小杆菌 ( Cur.flaccumfaciens) ,数值分析也支持这一结论。此外 ,据血清学反应结果及其对短小杆菌属的其它植物寄主的致病情况 ,认为该病原菌应是萎蔫短小杆菌种下一个新的致病变种 ,定名为 Curtobacterium flaccumfaciens pv.basellae pv.nov.(萎蔫短小杆菌落葵致病变种 )。

丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆表达与功能研究

采用PCR方法从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株中分别克隆到大小为1 026和1 038 bp的hrpZ基因(hrpZPsgA1和hrpZPsgS1),对该基因进行了原核表达和功能研究。SDS-PAGE显示其表达产物为相对分子质量62×103的融合蛋白,harpinZPsgA1和harpinZPsgS1的相对分子质量约为35×103。harpinZPsgS1的粗提蛋白经GSTrap FF纯化后质量浓度可达1.1 mg.mL-1。生物活性检测表明,该蛋白对热稳定,对蛋白酶K敏感,可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应,过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制,并且对烟草有明显的促生作用。序列比对发现,来自丁香假单胞大豆致病变种的hrpZ基因可分为2类,一类以hrpZPsgA1为代表,包括hrpZPsg12,另一类以hrpZPsgS1为代表,包括来自r0和Race4菌株的hrpZ基因。这2类hrpZ基因的核苷酸同源性为79%,氨基酸同源性为77%,均富含甘氨酸,不含半胱氨酸,与假单胞菌属以外的其他革兰氏阴性植物病原细菌harpin编码基因不存在相似性。

引起糖甜菜细菌性叶斑病的萎蔫短小杆菌新致病变种

1995年在内蒙古临河市新发现了糖甜菜细菌性叶斑病 ,从病斑所分离的 10个细菌菌株经柯赫氏法则验证 ,均确系该病的病原菌。采用形态观察、表型特征和生理生化特性测定、数值分析、血清学反应、细胞化学成分分析、DNAG +Cmol%和DNA DNA同源性测定进行了鉴定 ,并与植物病原棒形细菌 15个标准菌株进行了比较。该病原菌为革兰氏阳性细菌 ,不规则短杆状 ,有一根鞭毛、亚极生或侧生 ,结合其生理生化特性、细胞化学成分和DNAG +Cmol%和DNA DNA同源性测定结果 ,认为应属于短小杆菌属 (Curtobacterium)的萎蔫短小杆菌 (Cur.flaccumfaciens) ,数值分析也支持这一结论。此外 ,据血清学反应结果及其对短小杆菌属的其它植物寄主的致病情况 ,认为该病原菌应是萎蔫短小杆菌种下的一个新的致病变种 ,定名为Curtobacteriumflaccumfacienspv .beticolapv.nov.Chenetal.,2 0 0 0 (萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种 )

构树上一种新的丁香假单胞菌致病变种的研究

构树细菌性疫病是一种荧光假单胞菌引起的新病害。主要症状有叶片角斑,嫩梢肿大和幼枝溃疡。从江苏一带分离获得的12个构树菌株和3个桑树对比菌株进行交互接种试验,发现构树菌株与桑树菌株之间不能交互侵染其寄主。细菌学特征和LOPAT试验及其它37项生理生化和营养特性试验表明,两种菌的表型特征基本相似,仅在7种化合物的利用上存在差异。两种菌的血清学反应无相关性。细胞全蛋白SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱也略有不同。试验结果证明,构树细菌性疫病细菌属于假单胞菌属(Pseudomonas),丁香假单胞菌(P.syringae)的一个新致病变种,定名为Pseudomonas syrzngae pv. broussonetiae pv. nov.

水稻与油菜黄单胞菌菜豆致病变种非寄主互作体系中病原细菌过氧化氢的作用

【目的】探讨互作体系中病原菌来源过氧化氢的作用。【方法】采用组织化学法通过透射电子显微镜技术观察水稻与油菜黄单胞菌菜豆致病变种互作体系中的过氧化氢积累的定位。【结果】突变体菌株细胞中烷基过氧化物还原酶亚基C的缺失导致胞内其余过氧化氢清除酶活性的补偿性显著上升,使胞内内源过氧化氢积累水平显著下降,并引起病原菌与水稻互作体系中的过氧化氢积累水平发生显著变化。【结论】病原细菌很可能是互作体系中过氧化氢的一个重要来源。病原细菌产生的过氧化氢很可能在非寄主互作中造成细菌周围植物细胞的损伤,对植物细胞具有潜在的毒性。

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病。本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料),该ORF功能尚未见报道。序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonaseaeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因。对wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性。这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因。

我国几种禾谷类植物上Xanthomonas campestris致病变种的研究

从我国新疆、内蒙、西藏、北京和山东等省区的小麦、大麦、野黑麦、冰草、偃麦草和雀麦上分离到13个黑颖病菌株,在苗期、分蘖期和孕穗期,喷雾接种16属27种禾本科植物,对其中感病的6属15种植物和燕麦又做注射接种。根据各个菌株对小麦、大麦、黑麦、冰草、偃麦草和雀麦的致病性差异,初步将其划分三个致病变种:1.禾谷类致病变种]X.campestris pv.cerealis(Hagborg)Dye.]:包括7个菌株,自然条件下发生在冰草、雀麦和偃麦草上;人工接种还可侵染小麦、大麦和黑麦。2.小麦致病变种(X.campestris pv.undulosa):包括4个菌株,自然条件下发生在小麦上,人工接种可侵染大麦和黑麦,但有一个菌株注射接种能轻度侵染雀麦。3.大麦致病变种(X.campestris pv.hordei):包括2个菌株,自然条件下发生在大麦上,注射接种能轻度侵染偃麦草。13个菌株喷雾接种猫尾草、早熟禾、画眉草、马唐、狗尾草、稗草、披碱草、羊茅草和水稻、均不侵染。

丁香假单胞菌中六个致病变种的全细胞蛋白质电泳分析

利用聚丙稀酰胺电泳技术首次对丁香假单胞菌中６个致病变种全细胞蛋白电泳，发现同一致病变种内菌株蛋白条带一致，不同致病变种之间存在差异。以往对丁香假单胞菌中致病变种的鉴定方法主要是根据致病性的差异，结合营养筛选和血清学方法来进行。对丁香假单胞菌的６个致病变种的全细胞蛋白分析表明：全细胞蛋白质电泳能成功地鉴定到致病变种。

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中一个与EPS合成有关的新基因的鉴定

利用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xanthomonascampestrispv .campestris,简称Xcc)野生型菌株 80 0 4进行诱变 ,分离到一批胞外多糖 (EPS)合成减少的突变体。采用TAIL PCR(thermalasymmetricinter lacedPCR)分析突变体的Tn5gusA5插入位点 ,发现其中一株编号为 15 1D0 9的突变体的插入位点位于Xcc 80 0 4菌株的基因组编号为XC36 95的ORF内 ,该ORF功能尚未见报道。序列分析表明 ,该ORF演绎的编码产物与Serratiamarcescens的kdtX基因和Klebsiellapneumoniae的waaE基因演绎的编码产物分别具有 5 2 %和 5 0 %的相似性 ,并具有第 2家族糖基转移酶的功能域 ,因此暂将该ORF命名为waxE基因。用同源双交换方法构建了waxE基因的缺失突变体 ,并采用PCR和Southern杂交的方法对突变体进行了验证。waxE基因缺失突变体在营养丰富培养基的生长繁殖不受影响 ,但其EPS产量与野生型菌株 80 0 4相比 ,降低 35 %左右 ,并且一段PCR合成的包含waxE基因的DNA片段能反式互补waxE基因缺失突变体 ,恢复缺失突变体的EPS产量 ,表明XccwaxE基因与EPS的生物合成有关。

水稻黄单胞菌水稻致病变种rpfC缺失突变体在感病和抗病水稻品种中的繁殖和扩展

水稻黄单胞菌水稻致病变种（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）中国菌株１３７５１和水稻品种广桂１１０和ＩＲ２６的相互作用分别为亲和和不亲和相互作用。１３７５１的ｒｐｆＣ基因缺失突变株ＳＬ３７５１在电镜下的形态和野生型没有显著差别，均为短杆状，大小为（０．５～０．８）×（１．０～２．０）μｍ。用１０８ｃｆｕ／ｍＬ或１０１０ｃｆｕ／ｍＬ的ＳＬ３７５１剪叶接种苗期和分蘖盛期的广桂１１０，接种后５ｄ内ＳＬ３７５１在广桂１１０中的生长繁殖和野生型相似，但接种５ｄ后ＳＬ３７５１在其中的活菌数均稳定在１０６－７ｃｆｕ／叶，最终ＳＬ３７５１的活菌数比１３７５１的低１００倍左右。在抗病品种ＩＲ２６上，接种后５ｄＳＬ３７５１也增殖到１０６－７ｃｆｕ／叶，之后也保持在这一水平，最终ＳＬ３７５１的活菌数比野生型的低１０倍左右。另外，ＳＬ３７５１在被接种到广桂１１０和ＩＲ２６后，它被主要局限在剪叶接种切口下３ｃｍ范围内。野生型接种在广桂１１０上，接种后３ｄ就迅速沿叶脉往下扩展，野生型１３７５１在抗病品种ＩＲ２６中的扩展速度显著慢于其在广桂１１０中的扩展速度。所有这些都进一步证实ｒｐｆＣ基因在１３７５１在致病过程中起?

萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种的实时荧光定量PCR检测

依据萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种(Curtobacterium flaccumfacienspv.beticola)的16S^23S rRNA间隔区ITS序列,设计引物CfbF/CfbR。PCR扩增3个糖甜菜叶斑菌及29个参比菌株,仅靶标菌扩增出191 bp产物。用SYRB Green I荧光染料进行实时荧光定量PCR检测,制作标准曲线,回归直线决定系数R2为0.99。整个检测过程操作便捷,仅需2 h,可灵敏、特异、定量地对该病原菌进行检测。

双抗体夹心酶联免疫方法检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌

丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌可以引起十字花科细菌性黑斑病,是侵染萝卜、白菜、花椰菜等农作物的重要病害之一。以灭活的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌(NCPPB1820)为免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤细胞技术,筛选最终获得6株产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。将辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)与抗体偶联,作为检测探针,分别将6种单克隆抗体作为包被抗体,进行两两配对筛选。结果表明,所制备的抗体特异性较好,对水稻细菌性谷枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、玉米细菌性枯萎病菌、丁香假单胞菌丁香致病变种均没有交叉反应。以6号抗体作为检测抗体(6-HRP),以1号抗体作为包被抗体,建立酶联免疫分析法获得了最佳的敏感度。检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种的最低检测限为1.5×105cfu/m L,定量限为4.12×105cfu/m L。基于双抗体夹心的酶免疫方法特异性好,便捷,可以实现对丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌高通量测定。

1株三型丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌全基因组扫描图测序及分析

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,简称Psa)是引起猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌。对从感染溃疡病的东红猕猴桃枝条中分离得到的1株Psa野生株(命名为GX05)进行全基因组测序,获得基因组草图,分析其中毒力基因、耐药基因和致病基因的情况。研究发现,多位点序列分型结果显示GX05为biovar 3,与毒力因子数据库比对,GX05携带99种毒力因子及692个相关毒力基因,同源性和匹配度最高的毒力因子是PvdL和Irp1;与综合抗生素抗性基因数据库比对,GX05携带336种耐药基因,与29种抗生素有关;与病原宿主互作数据库比对,不表达导致病原菌致病力减弱的基因数量最多,其中同源性和匹配度最高的是PvdL,此外与增强致病力相关的同源性和匹配度最高的基因是hrcC。通过全基因组测序信息初步分析了1株三型Psa菌株中存在的毒力、耐药及致病基因情况,对深入研究其致病机制和合理用药有重要意义。

四川省丁香假单胞猕猴桃致病变种的遗传多样性分析

为明确四川省猕猴桃溃疡病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)的遗传多样性及群组划分与地理来源的相关性。以四川省不同地理来源的40个Psa菌株为研究试材,用rep-PCR技术进行分子标记,NTSYS软件分析UPGMA聚类。3对rep-PCR检测引物(REP、ERIC和BOX)共获得42个位点,其中38个为多态位点,占90.5%。UPGMA聚类结果显示,以相似系数为0.70阀值时,40个Psa菌株被分为2个类群(Ⅰ、Ⅱ),其中85.0%的菌株属于第Ⅱ类群;在相似性系数为0.80时,第Ⅰ类又可分为2个亚类(Ⅰ-1、Ⅰ-2),第Ⅱ类则分为5个亚类(Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5),菌株无明显的采集地聚类。以上结果表明,四川省各地区的猕猴桃溃疡病菌菌株具有较高的遗传多样性,但其遗传变异与菌株地理来源无明显相关性。

番茄SlβCA3在防御丁香假单胞菌番茄致病变种中的功能

【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO_(2)浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶(βcarbonic anhydrase,βCA)是植物CO_(2)感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄(Solanum lycopersicum)等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型(wild-type,WT)番茄‘Ailsa Craig’(AC)为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000),利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株(OE-SlβCA3)。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工(糖基化),氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。

丁香假单胞大豆致病变种不同HrpZ蛋白差异区域功能研究

[目的]丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株编码产生的Hrp Z蛋白差异序列主要集中在C端的3个区域,并且这2个蛋白诱导非寄主HR的能力也存在差异。本研究将探究Hrp Z蛋白这3个差异区域在烟草上诱导HR(hypersensitive response)和抑制烟草花叶病毒(TMV)中所起的作用。[方法]采用常规PCR及重叠PCR方法将这2个hrp Z基因的3个差异区域分别进行互换,构建了相应的重组表达载体,表达并纯化得到了6个重组蛋白,相对分子质量均在41×103左右。并检测了其诱导HR活性、诱导植物抗病性。[结果]检测结果表明:重组蛋白Hrp ZS(S2→A2)和Hrp ZA(A3→S3)诱导HR的能力相比亲本都有所增强,6个重组蛋白诱导烟草抗TMV的活性都明显强于亲本,其中,Hrp ZA(A3→S3)和Hrp ZS(S3→A3)的活性最强。[结论]此试验表明Hrp Z蛋白的这些差异区域(第7、8、9个α-螺旋)是过敏反应能力的主要调控区域,同时C-端第8、9个α-螺旋区域与诱导植物抗病性也显著相关。本研究为改造Hrp Z类harpin蛋白激发子,提高其诱导抗性及功能域研究提供了理论依据。