Stl阻遏因子控制葡萄球菌引起中毒性休克的“致病性岛”

葡萄球菌中毒性休克综合症（staphylococcal tox-ic shock syndrome,STSS）是一种潜在的致命疾病,以发烧、低血压、剥脱性皮疹、腹泻、呕吐,最终导致休克和多脏器系统功能障碍等为特征。其女性发病率显著高于男性,其中90%与月经来潮有关,近年来检测资料显示,皮肤和外科感染引起的STSS有增多趋势。

针对鼠伤寒沙门氏菌致病性岛Ⅲ筛选中药活性成分作为鼠伤寒沙门氏菌潜在毒力抑制剂

目的:筛选中药活性成分作为鼠伤寒沙门氏菌致病性岛III(Salmonella pathogenicity island III,SPI-3)潜在毒力抑制剂。方法:通过分子对接技术明确中药成分与SPI-3中的MgtC蛋白的潜在结合关系。使用β-半乳糖苷酶测定法评估中药成分对mgtC转录的影响。最后,通过评估细菌生长曲线和关键代谢基因的转录水平研究药物对细菌生长的影响。结果:所有27个候选中药成分均显示出与MgtC结合的潜力。阿魏酸、对羟基肉桂酸、牛蒡子苷和掌叶防己碱使mgtC的转录活性降低了15%以上。这四个成分对mgtC转录的最低抑制浓度分别为:阿魏酸16μM;对羟基肉桂酸40μM;牛蒡子苷80μM;掌叶防己碱160μM。此外,我们证实这四种成分均未抑制细菌生长。结论:在本研究中,我们建立了一种基于β-半乳糖苷酶测定法的鼠伤寒沙门氏菌毒力抑制剂筛选方法。以SPI-3为靶标,筛选了27种中药成分,发现有4种对鼠伤寒沙门氏菌毒力具有潜在的强效抑制作用。这为未来从草药中开发新型抗生素提供了先导化合物。这种方法也可用于筛选其他致病菌的毒力抑制剂。

高致病性毒力岛Irp1介导的细菌对Vero细胞黏附作用

高致病性毒力岛(HPI)已经在多种类型大肠杆菌中被发现。为了解HPI-Irp1在细菌致病中的作用,通过生物软件DNAStar的分析,筛选出HPI中irp1和fyuA基因上10个表位作用优势较强的区域。设计特异性引物10对,进行PCR扩增,将获得的PCR产物,插入原核表达载体pET32a,构建重组质粒;将获得的重组质粒转化进入菌毛阴性宿主菌BL21,获得的重组菌用IPTG诱导表达后与Vero细胞混合进行体外作用。结果表明:带有irp1-1基因片段的重组菌BL21-rpET32a-irp1-1表现出对Vero细胞较强的聚集黏附作用,空载体对照和宿主菌对照均未出现相关现象。因而推测irp1-1基因片段编码的产物在细菌对宿主致病过程中,介导了细菌与宿主细胞的相互作用。

致病性大肠埃希菌高致病性毒力岛irp2基因序列的扩增与分析

目的探讨致病性大肠埃希菌(EPEC)中高致病性毒力岛(HPI)irp2基因与致病性的关系。方法根据Genebank中irp2基因设计特异性引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增基因全长,克隆入pUCm-T载体,并通过酶切和测序鉴定。结果160株EPEC中有16株(10.00%)扩增出278bp基因片段,该基因片段与GeneBank中公布的耶尔森菌HPIirp2基因的同源性高达97%以上。结论部分EPEC具有耶尔森菌毒力岛HPI基因序列,该毒力岛可能与EPEC的致病性有一定相关性。

猕猴源大肠杆菌药敏试验与高致病性毒力岛基因的检测

为探究腹泻猕猴粪便中分离出的大肠杆菌(E.coli)是否携带高致病性毒力岛(HPI)相关基因,并分析其耐药性和致病性,本试验采集23只腹泻猕猴的粪便,用麦康凯培养基、LB琼脂和生化鉴定管对E.coli进行分离鉴定,通过PCR试验、纸片扩散法和动物回归试验,研究分离菌株的HPI基因携带情况、耐药性、致病性,并且进行全基因组测序验证。结果显示,23份样品中均分离出E.coli,分离率为100%;分离出的E.coli中HPI标志基因irp 2携带率高达47.83%,其余基因irp 1、irp 3、irp 4、irp 5、irp 6、irp 7、irp 8、irp 9、fyuA、intB和ybtA携带率分别为65.22%、34.78%、47.83%、69.57%、56.62%、43.48%、39.13%、43.48%、34.78%、65.22%和26.09%;在分离出的23株E.coli菌株中携带HPI全岛基因的有5株,占21.74%,这5株E.coli HPI阳性菌株(HPI+)对阿米卡星、环丙沙星、头孢哌酮、头孢噻肟、苯唑西林、四环素、头孢唑林、头孢曲松的耐药性都极高,对氯霉素较敏感;接种E.coli HPI+菌株后8 h小鼠死亡率为100%,接种E.coli HPI-菌株后12 h小鼠死亡率为25%;用2株E.coli HPI+全基因检测的结果构建了2个基因组圈图,其中1株(H-7)预测到5300个编码基因,其总长4728917 bp;另1株(H-23)预测到5460个编码基因,其总长4811637 bp。结果表明,猕猴腹泻源致病性E.coli HPI基因携带率较高、耐药性普遍存在,同时致病性E.coli HPI+可提高小鼠死亡率,本试验通过COG、GO、KEGG获得大量的基因功能注释结果,从基因组水平加深了对E.coli HPI+的认识。

撒坝猪源大肠杆菌高致病性毒力岛诱导病理损伤的超微结构特征

为探究撒坝猪源大肠杆菌(E.coli)高致病性毒力岛(HPI)诱导小鼠病理损伤的超微结构特征,本研究将实验室保存的E.coli HPI阳性株(HPI^(+))和E.coli HPI基因缺失株(ΔHPI)进行复苏和培养,分别用E.coli HPI^(+)、E.coli^(Δ)HPI菌株以腹腔接种的方式感染昆明小鼠,检测菌株的半数致死量(50%lethal dose,LD50),通过HE染色和透射电镜观察并分析菌株对小鼠病理损伤的超微结构特征,利用免疫组织化学标记白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)阳性细胞在被感染小鼠肝脏和肾脏组织中的分布,以反映E.coli HPI+及E.coliΔHPI菌株所引起炎症水平的差异。结果显示,E.coli HPI^(+)和E.coli^(Δ)HPI菌株的半数致死量分别为1×10^(7.39)和1×10^(8.62)CFU/mL;HE染色显示,E.coli感染小鼠后,可见肝脏细胞肿胀、变性,肝窦淤血,肾脏间质淤血,肾小管上皮细胞变性脱落等病理变化;超微结构变化显示,肝脏细胞的完整形态消失,胞核呈不规则形态,线粒体畸形,粗面内质网上核糖体脱落,滑面内质网增生;多数肾小管上皮细胞出现胞核固缩,部分细胞核核仁边移、体积增大,足突融合,系膜细胞间隙变宽。此外,E.coli HPI^(+)感染组小鼠于肝脏、肾脏的水肿现象较E.coli^(Δ)HPI菌株感染的小鼠更为明显。免疫组化结果显示,大肠杆菌感染小鼠后,IL-1β蛋白主要表达于肝细胞、中央静脉周围、肾间质细胞和肾小管上皮细胞,且E.coli HPI^(+)感染组的IL-1β表达量高于E.coli^(Δ)HPI感染组。综上所述,撒坝猪源E.coli HPI能够调控E.coli对小鼠的致病性,HPI的调控作用可使E.coli对小鼠肝脏、肾脏造成的病变及超微结构变化更明显,并且能够增加小鼠的炎症反应。

撒坝猪源E.coli高致病性毒力岛通过NLRP3/ASC/Caspase-1途径诱导IPEC-J2细胞焦亡

旨在研究撒坝猪源E.coli高致病性毒力岛(highly pathogenic virulence island,HPI)诱导IPEC-J2细胞焦亡的机制,本研究以LPS+ATP为阳性对照,将实验室前期筛选的E.coli HPI及通过CRISPR/Cas9基因敲除技术构建完成的E.coliΔHPI感染IPEC-J2细胞,观察细胞损伤情况;RT-qPCR测定各组作用0.5、3、6、9、12 h后细胞内焦亡通路中关键因子NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、胱天蛋白酶-1(caspase-1)、消皮素D(gasderminD,GSDMD)及炎性因子白介素-18(IL-18)、白介素-1β(IL-1β)的mRNA转录水平;激光共聚焦观察NLRP3/Caspase-1炎性复合体组装及表达情况;Western blot测定GSDMD及其活化形式GSDMD-N蛋白表达水平,PI染色检测胞膜完整性。结果表明:LPS+ATP处理显著促进细胞焦亡的发生,阴性对照组细胞正常生长、轮廓清晰,E.coli感染组及LPS+ATP组细胞出现变形、脱落、边界模糊等明显细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),且HE染色显示,E.coliHPI感染相较于E.coliΔHPI感染对细胞的损伤更严重;E.coli HPI组中的焦亡通路关键因子及炎性因子mRNA水平在3~9 h均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于E.coliΔHPI组;NLRP3/Caspase-1炎性复合体在细胞质中发生组装,且E.coli HPI组NLRP3/Caspase-1蛋白荧光强度、GSDMD、GSDMD-N蛋白表达水平及PI染色阳性率均极显著(P<0.01)高于E.coliΔHPI组;E.coli HPI组的CPE、HE染色、焦亡通路关键因子及炎性因子mRNA水平、GSDMD及GSDMD-N蛋白表达量、NLRP3/Caspase-1共定位情况均与LPS+ATP组相似。结果提示,撒坝猪源E.coliHPI通过上调NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路中关键因子mRNA水平,诱导NLRP3/Caspase-1炎性复合体的组装,促进焦亡标志蛋白GSDMD及GSDMD-N的表达,并对IPEC-J2细胞膜进行打孔,从而诱导细胞发生焦亡。

致病性大肠杆菌HPI对Caspase-1细胞焦亡相关分子表达的影响

为研究云南撒坝猪致病性大肠杆菌高致病性毒力岛(HPI)致猪源巨噬细胞焦亡的分子机制,本试验以云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI阳性株感染猪源巨噬细胞为切入点,从云南楚雄州某规模养殖场采集撒坝猪仔猪黄白痢的粪便,对大肠杆菌进行分离纯化,并通过PCR技术对HPI irp 2基因进行检测,分别以HPI阳性株(HPI+)和阴性株(HPI-)感染巨噬细胞,并设立LPS+ATP组和空白对照组,于0.5和6 h收集各组细胞及其上清。应用实时荧光定量PCR法检测不同组Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平的变化;应用ELISA检测细胞上清pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含量的变化。结果显示,试验成功分离得到致病性大肠杆菌,经PCR检测成功获得HPI irp 2基因阳性株,经实时荧光定量PCR法检测后发现HPI+组、HPI-组与空白对照组相比,Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平均呈上调趋势,且HPI+组高于HPI-组。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,HPI+组和HPI-组pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18的蛋白表达量普遍呈上调趋势,且HPI+组均高于HPI-组。结果表明,云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI可通过上调猪源巨噬细胞中Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表达量促进猪源巨噬细胞炎性因子IL-1β和IL-18的释放,诱发炎症,最终促进猪源巨噬细胞发生细胞焦亡。

禽源性大肠杆菌HPI irp2基因序列的扩增及比较

从养殖场发病家禽中分离到多株禽源性大肠杆菌(E scherich ia coli),用其中Y ZG 040515、NTLFC 040402、CHZ031016菌株提取细菌高致病性染色体DNA,根据耶尔森菌高致病性毒力岛(HP I)irp 2基因设计引物,用PCR扩增出278 bp基因片段。将PCR产物克隆到pGEM-T-easy中,经E coRⅠ酶切鉴定为阳性者进行序列测定。结果表明:该基因片段与G eneB ank中发布的耶尔森菌HP I irp 2基因的同源性高达98%以上,证明禽源性大肠杆菌中具有耶尔森菌毒力岛HP I基因序列,结合临床发病情况和流行病学,提示该毒力岛与日趋严重的家禽大肠杆菌病可能有一定的相关性。

炭疽杆菌质粒的基因组结构研究进展

炭疽杆菌由于致病力强,又能通过空气传播而造成大批人死亡,现已被恐怖分子利用作为生物武器。为认识这种细菌的毒力和致病机制,本文对近年来炭疽杆菌毒素质粒(PX01)和荚膜质粒(PX02)的基因组结构综述如下。

猪源E.coli HPI通过NLRP3/ASC/Caspase-1诱导巨噬细胞焦亡的机制

为探讨猪源E.coli高致病性毒力岛(high pathogenicity island,HPI)对巨噬细胞焦亡的影响,以内毒素(LPS)联合三磷酸腺苷(ATP)建立焦亡阳性对照,使用E.coli WT株(E.coli HPI^(+))和前期构建的E.coli HPI敲除株(E.coliΔHPI)感染巨噬细胞,在感染后不同时间点收集细胞,运用PI染色观察细胞膜损伤情况;RT-qPCR测定NLRP3/ASC/Caspase-1焦亡通路中关键因子的mRNA水平;共聚焦观察NLRP3和Caspase-1的炎性复合体的组装;Western blot技术测定GSDMD和cleaved-GSDMD的表达。结果显示,与E.coliΔHPI组相比,E.coli HPI^(+)焦亡通路关键因子NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD及炎症因子IL-18、IL-1β的mRNA水平均升高;NLRP3和Caspase-1蛋白的表达量升高,共聚焦观察到共定位;E.coli HPI^(+)组的GSDMD及其活性形式cleaved-GSDMD的表达水平高于E.coliΔHPI组。E.coli HPI感染巨噬细胞后,通过上调NLRP3/ASC/Caspase-1通路中关键因子mRNA的水平,诱导NLRP3和Caspase-1炎性复合体的组装,促进cleaved-GSDMD的表达,从而加剧细胞膜损伤,最终诱导巨噬细胞发生焦亡。

假结核耶尔森菌毒力相关基因的检测及序列分析

目的对来自不同血清型的29株假结核耶尔森菌的主要毒力相关基因进行检测及序列分析,初步了解假结核耶尔森菌主要毒力基因的分布与变异情况。方法应用的聚合酶链反应(PCR)技术进行血清学分型与毒力基因(inv、pYV、HPI毒力岛、ypm)检测,并对ypm基因扩增基因进行测序比较。结果29株实验菌株均携带编码侵袭素的inv基因,15株携带毒力质粒(pYV),13株携带全部或部分HPIs基因簇,19株携带ypmA基因,1株携带ypmB基因,1株携带ypmC基因。结论假结核耶尔森菌毒力基因的分布具有一定的多态性。