致病疫霉菌效应蛋白Pi05440毒性功能验证及寄主候选靶标筛选

致病疫霉菌(Phytophthora infestans)侵染时会分泌大量效应蛋白进入寄主细胞,通过操纵寄主靶标抑制植物免疫反应。为研究致病疫霉菌效应蛋白Pi05440的功能,本研究重点分析了Pi05440的蛋白特征、毒性功能及鉴定其寄主靶标;利用生物信息学数据库,预测Pi05440的保守结构域和信号肽。构建pRI101-GFP-Pi05440表达载体用于Pi05440的亚细胞定位和毒性功能分析;同时,利用酵母双杂交技术对Pi05440的寄主靶标蛋白进行了筛选和鉴定。结果表明,Pi05440基因全长969 bp,编码322个氨基酸。结构预测结果显示Pi05440含有3个典型的KAZAL功能域。亚细胞定位结果表明Pi05440定位在质膜和细胞间隙。在本氏烟中瞬时表达该基因显著促进致病疫霉菌扩展。通过酵母双杂交筛选,初步鉴定到3个Pi05440的候选靶标蛋白,分别为马铃薯过氧化氢酶12、马铃薯几丁质酶以及马铃薯MYB-like A蛋白。本研究为探究致病疫霉菌效应蛋白Pi05440及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供了重要线索。

致病疫霉菌无毒基因AVR3a的克隆与序列分析

根据GenBank中致病疫霉菌无毒基因AVR3a序列(AJ893357)及参考文献中的特异引物(Pex147F,Pex147R),以致病疫霉菌基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到了特异性扩增片段,并对特异片段进行纯化和测序。结果表明,该片段的长度为451 bp,经序列分析表明,其氨基酸编码序列为441 bp,共编码147个氨基酸。BLAST分析结果显示,该片段核苷酸序列与无毒基因AVR3a核苷酸序列的同源性为99.34%,氨基酸序列比对结果表明,氨基酸序列在第19、80和103位存在着差异,这些核苷酸序列差异以及某些关键氨基酸的改变有可能是导致不同菌株中AVR3a毒性变异的原因。

福建省致病疫霉菌SRAP遗传多样性分析

为了解福建省致病疫霉菌的群体遗传结构,为该病原菌的遗传进化提供理论依据,笔者应用SRAP分子标记技术对福建省致病疫霉菌的群体遗传多样性,及不同地区菌株间的关系进行比较分析。利用10个菌株从110对引物组合中筛选出多态性引物10对,对分离自福建省10个不同市(县)的62个致病疫霉菌菌株DNA进行PCR扩增,共产生92条谱带,其中多态性标记90条,多态检测率为97.8%。利用NTSYpc Version2.1软件对供试菌株间的遗传距离进行聚类分析并构建系统树状图。以遗传距离0.57为阈值,可将供试62个菌株划分为4个遗传聚类组,SRAP分组与菌株的地理来源、寄主均无明显相关性。聚类分析结果表明,福建省不同地区的致病疫霉菌整体亲缘关系相近,但各菌株间存在遗传差异。

不同浓度臭氧水对致病疫霉菌Phytophthora infestans孢子萌发抑制作用初报

采用不同浓度臭氧水对致病疫霉菌Phytophthora infestans(Mont.)de Bary孢子囊萌发进行了试验,结果表明:臭氧水处理对孢子囊萌发的影响与臭氧水浓度密切相关,以9 mg/kg臭氧水处理1 min可以抑制95%以上孢子囊萌发,以18 mg/kg臭氧水处理1 min则100%抑制孢子囊萌发。无论在高浓度还是在低浓度条件下,处理时间1 min或2 min对孢子囊萌发没有产生显著影响,杀菌作用几乎是瞬间完成的。臭氧水处理孢子囊后导致孢子囊形态发生变化,这种变化随时间延长变得更加明显。鉴于高浓度臭氧水对植物本身不产生毒害作用,因此,高浓度臭氧水在控制晚疫病方面显示出广阔的应用前景。

抗甲霜灵致病疫霉菌对5种杀菌剂的敏感性测定

为明确致病疫霉菌甲霜灵抗性菌株对氟吗啉、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、烯酰吗啉和霜脲氰的敏感性,采用菌丝生长速度法,并用叶盘漂浮法加以比较,测定了致病疫霉菌甲霜灵抗性菌株和敏感性菌株对供试杀菌剂的敏感性。试验结果表明,供试5种杀菌剂对致病疫霉菌甲霜灵抗性和敏感菌株的菌丝生长、孢子囊的形成都具有明显的抑制作用。对致病疫霉菌甲霜灵抗性菌株毒力最强的杀菌剂是氟吗啉,其平均EC50值为0.037 6μg.mL-1,致病疫霉菌间对霜脲氰的敏感性差异显著,EC50值在0.008 4～0.868 1μg.mL-1之间,其中甲霜灵抗性菌株平均EC50值为0.386 6μg.mL-1。菌丝生长速率法离体测定表现出与叶盘漂浮法结果具有较高的相关性,供试杀菌剂与甲霜灵不存在交互抗性,可作为甲霜灵的替代药剂防治番茄和马铃薯晚疫病。

致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like寄主靶标的酵母双杂交筛选

由卵菌病原物致病疫霉菌引起的马铃薯晚疫病是造成马铃薯毁灭性损失的病害。为了筛选致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like(AL)的寄主靶标,以致病疫霉菌88069菌株的DNA为模板,克隆致病疫霉菌效应蛋白AL,并将其成功构建到pGBKT7载体上,形成诱饵载体。将pGADT7和重组诱饵载体共转化到酵母感受态AH109中,检测到诱饵载体无自激活作用。利用酵母双杂交技术以AL为诱饵筛选晚疫病菌侵染12 h后的番茄cDNA文库,初步获得6个候选AL寄主靶标。对6个候选靶标与AL进行一对一互作验证,结果表明其中有5个与诱饵载体强互作,1个弱互作。这些候选寄主靶标包括热休克蛋白同源蛋白、单脱氢抗坏血酸还原酶蛋白、过氧化物酶体蛋白等。

利用酵母双杂交筛选与致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586互作的寄主蛋白

致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的病原菌,其分泌的效应蛋白是侵染寄主的重要毒力因子。本研究在致病疫霉转录组中筛选到一个侵染早期表达的效应蛋白基因PITG_07586(GenBank:XM_002904522.1)。该基因全长447 bp,其编码蛋白包含1个信号肽,1个核定位信号序列(RRRRKRRKKKK)。在本氏烟草中,瞬时表达该基因显著促进病原菌侵染。亚细胞定位表明GFP-PITG_07586定位在细胞核中。利用酵母双杂交技术并以PITG_07586为诱饵筛选马铃薯cDNA文库,最终获得3个靶标蛋白。经序列比对分析,这3个靶标蛋白分别是马铃薯POM30蛋白、电压依赖阴离子通道蛋白VDAC以及SRC2类蛋白。研究结果为致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供重要依据。

马铃薯StBI-1基因鉴定及其抗疫霉菌的功能探索

Baxinhibitor1(BI-1)是真核生物中高度保守的细胞死亡调节因子,在植物响应生物与非生物胁迫中扮演重要角色。为探究BI-1是否参与马铃薯响应疫霉菌侵染的免疫应答,首先以拟南芥AtBI-1蛋白序列为模板在马铃薯蛋白数据库中进行BLAST检索。通过比对分析及构建系统进化树,鉴定到与AtBI-1相似度为77.22%的马铃薯蛋白NP_001305552.1,将编码该蛋白的马铃薯基因命名为StBI-1;蛋白结构预测分析表明,StBI-1包含7个跨膜域和Baxinhibitor-1-like家族结构域。利用实时定量PCR分析StBI-1基因在马铃薯响应致病疫霉菌侵染过程中的表达模式,并借助农杆菌介导的烟草瞬时表达体系初步探索StBI-1抗疫霉菌的生物学功能。结果显示,StBI-1响应致病疫霉菌侵染而诱导上调表达,尤其是在侵染后期。同时,过表达StBI-1可显著增强本氏烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性。综合以上结果,本研究对马铃薯BI-1基因进行鉴定分析及克隆,并初步揭示StBI-1抗疫霉菌的生物学功能,为挖掘马铃薯抗晚疫病新型基因资源及深入解析其抗病分子机理奠定了理论基础。

种薯药剂处理防治大田马铃薯晚疫病试验

对利用药剂处理马铃薯种薯的方法进行研究,比较3种杀菌剂在2种含量水平上防治马铃薯晚疫病的效果,以期确立种薯处理防治马铃薯晚疫病应用技术,评估其生产推广价值。用商业化广泛使用的克露、安克以及银法利3种药剂和2个含量分别处理种薯,从马铃薯生长后期植株的发病率、发病部位以及发病程度等方面,系统分析不同药剂浸种处理对马铃薯晚疫病的防控效果。结果表明,50%安克WP 350倍液的种薯处理,植株发病率最低,叶片发病数最少,发病级数最低,防治效果最好。可见,种薯处理作为马铃薯晚疫病防控环节中的一个重要措施,通过有效防控来自带菌种薯的初侵染及其初始菌源来控制病害的发生。

哈尔滨市马铃薯晚疫病菌生理小种的类型

马铃薯晚疫病是由致病疫霉菌[Phytophtora infestans(Mont.)de Bary]引起的毁灭性病害,近年来,该病害在哈尔滨市连年发生,危害日趋严重。本研究对2010年从哈尔滨市采集62个马铃薯晚疫病菌分离物进行了生理小种鉴定。结果表明,在62个分离物中,共有14个小种类型,以1.3.4.7.8.10.11小种为主,出现频率为33.87%,其次是小种1.3.4.7.8.和1.3.4.7,出现频率分别为14.52%和12.90%,没有鉴定出单基因小种。这充分说明,哈尔滨市致病疫霉菌毒力结构呈多样性,具有高度的复合性。

黑龙江省和吉林省马铃薯晚疫病菌multi-locus基因型分析

2006～2008年在黑龙江省和吉林省共分离获得99株马铃薯晚疫病菌,并测定了这些菌株的交配型、瑞毒霉敏感性、同工酶基因型和mtDNA单倍型。交配型测定结果显示在吉林省和黑龙江省分离的所有菌株均为A1交配型。瑞毒霉敏感性测定结果显示敏感性菌株占14.1%,中抗菌株占7.1%,抗性菌株占78.8%,表明吉林省和黑龙江省发生的晚疫病菌已对瑞毒霉产生抗药性。黑龙江省和吉林省分离的所有菌株中发现了两种mt DNA单倍型(Ⅰa和Ⅱa)。其中,Ⅰa单倍型占11.1%,Ⅱa单倍型占88.9%。根据Gpi和Pep图谱,本试验发现了3种同工酶基因型,其中优势同工酶基因型是Gpi:100/100,Pep:100/100。根据菌株的交配型、同工酶基因型和mtDNA单倍型,共发现4种基因型,其中,multi-locus基因型A(84.9%)是黑龙江省和吉林省发现的优势基因型,但也出现了新的基因型分化。

番茄早疫和晚疫病害病原菌鉴定及室内药剂的筛选

对兰州市皋兰县高山村番茄连作田病害调查发现,其主要病害为早疫病和晚疫病,病原菌鉴定为茄链格孢(Alternaria solani)和致病疫霉菌(Phytophthora infestans);番茄早疫、晚疫病病菌在番茄葡萄糖琼脂培养基上生长最好;接种不同方式、番茄不同品种对晚疫病的抗性都存在一定差异,其中在有伤接种条件下番茄果实病斑扩展速度明显快于无伤接种;巨霸最感病,德富次之;捷美153最抗病;室内药剂筛选结果表明,10%苯醚甲环唑和72%霜脲·锰锌对番茄早疫病菌抑菌效果最好,抑菌率分别为100%和98.35%;10%烯酰吗啉和72%霜脲·锰锌对番茄晚疫病菌抑菌效果最好,抑菌率分别为98.71%和100%。

黑龙江省马铃薯晚疫病菌交配型、瑞毒霉敏感性及mtDNA单倍型分析

2012-2014年在黑龙江省各马铃薯主产区共分离了151株马铃薯晚疫病菌,并测定了晚疫病菌的交配型、瑞毒霉敏感性和mt DNA单倍型。交配型测定结果显示,分离的151株马铃薯晚疫病菌中,A1交配型为103株（68.2%）,自育型为33株（21.9%）,A2交配型为15株（9.9%）。这说明黑龙江省马铃薯晚疫病菌的群体结构发生了明显的变化。瑞毒霉测定结果显示,2012-2014年分离的151株菌株中敏感性菌株占3.3%,中抗菌株占6.6%,抗性菌株占90.1%,表明黑龙江省部分马铃薯主产区分离的晚疫病菌已对瑞毒霉产生抗药性。线粒体DNA单倍型的测定结果显示在黑龙江省部分马铃薯主产区共发现了3种线粒体DNA单倍型,分别为Ia,Ib和IIa。其中,IIa mt DNA单倍型的数量最多,发生频率为86.1%。这说明IIa mt DNA单倍型是黑龙江省部分马铃薯主产区的优势种群。

马铃薯晚疫病菌效应子PITG_16427.2的基因序列分析及功能验证

马铃薯晚疫病的病原是致病疫霉菌(Phytophthora infestans),该病原菌在侵染马铃薯过程中分泌大量RxLR型效应子,但目前绝大多数RxLR效应子的功能和作用机制尚不明确。本研究成功克隆了致病疫霉菌的一个RxLR效应子PITG16427.2,在本氏烟中瞬时表达PITG16427.2,发现该效应子能够抑制6种激发子(INF1、PsojNIP、BAX、SIF2、Avh238、Avh241)激发的植物免疫反应。进一步研究发现,效应子PITG16427.2在晚疫病菌侵染马铃薯早期上调表达。在15个致病疫霉菌株和3个同属菌株中克隆该基因,克隆到氨基酸序列一致性超过93%的同源基因,这些同源基因均能在本氏烟中抑制INF1和Avh241引起的HR,揭示了该效应子在病原卵菌中序列和功能的高度保守性。在本氏烟和马铃薯感病品种Désirée中瞬时表达PITG16427.2,发现该效应子能够显著促进晚疫病菌的侵染。通过qRT-PCR方法检测发现,乙烯信号的相关基因ERF1显著上调,而水杨酸信号相关基因PR1b显著下调,表明PITG16427.2在晚疫病菌侵染过程中可抑制寄主的SA信号途径,促进晚疫病菌侵染。因此,RxLR型效应子PITG16427.2是致病疫霉菌中一个重要的侵染致病因子。