致细胞病变型新疆BVDV基因2型毒株的分离鉴定及其致病性

为了解新疆博乐地区某牛场牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况及致病性,采用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测粪便样品,将阳性病料接种至胎牛肾细胞(madin-darby bovine kidney,MDBK),盲传15代后通过5轮蚀斑纯化试验得到1株致细胞病变型(cytopathic type,CP)BVDV毒株;通过理化性质检测、间接免疫荧光试验、电镜观察、基因序列分析及小鼠致病性试验对该毒株进行鉴定。结果显示:成功分离纯化得到1株CP BVDV毒株,将其命名为BVDV-BL314株;盲传15代BVDV毒株接种至MDBK细胞培养引起明显的细胞皱缩、变圆、碎裂、脱落、产生合胞体等致细胞病变效应(cytopathogenic effect,CPE);测定该毒株的滴度为2×10^(8) TCID50/0.1mL;理化性质检测发现该病毒对乙醚、氯仿等有机溶剂敏感,对酸碱敏感;56℃处理30min可显著性降低病毒活性;间接免疫荧光试验检测胞浆中可见特异性荧光;电镜观察该病毒呈球形,直径为40~60nm;遗传进化分析显示该分离株与BVDV-125c株有较近的亲缘关系,属于BVDV-2a基因亚型;免疫BALB/c小鼠后,剖检表现为多器官肿大、出血、质地变脆,边缘钝圆,无光泽等症状;镜检可见炎性细胞浸润、出血等变化。结果表明,分离纯化得到1株致细胞病变型新疆地方性BVDV基因2型毒株,且具有较强的致病性,将为新疆BVDV流行病学调查及致病机制研究提供依据。

牛病毒性腹泻病毒长春分离株P125基因的克隆与序列测定

以MDBK细胞培养致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)NCD毒株 ,采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA ,并根据BVDVNADL参考株序列设计合成的 1对引物 (W 1与W 2 ) ,进行反转录PCR (RT PCR) ,扩增出P12 5基因区约40 0bp的片段。经 pGEM T载体连接后克隆、测序 ,并与已发表的NADL、Osloss、SD 1、184、D、H、Yak等BVDV毒株序列进行比较。结果表明 :NCD株P12 5基因区无插入或缺失变异 ,但存在着核苷酸的替换 ;经聚类分析初步认为NCD株属于Ⅰa型。NCD株与长春 184、H株核苷酸序列差异较大 ,而亲缘关系较近 。

牛病毒性腹泻病毒XC株的分离与鉴定

将BVDV阳性血清样品接种MDBK细胞,结果分离出1株BVDV。采用MDBK细胞培养法、直接免疫荧光、RT-PCR与TCID_(50)等方法对分离毒株进行鉴定分析。结果表明,分离株在MDBK细胞上盲传至10代均未出现细胞病变;在直接免疫荧光试验中呈阳性;RT-PCR扩增均获得5'-UTR、Npro预期大小DNA片段;分离株滴度为10^(-5.9)TCID_(50)/0.2 mL。进化分析显示,该分离株属于BVDV-1m。以上结果推断,成功分离鉴定1株BVDV,该分离株为非致细胞病变型BVDV-1m,命名为BVDV-1 XC株,为研究致病机理奠定基础。