致肾盂肾炎大肠杆菌的毒力因子和调控

致肾盂肾炎大肠杆菌引起人的尿路感染,它的毒力因子包括表面毒力因子和分泌毒力因子两大类。表面毒力因子包括菌毛、鞭毛、黏附素和多糖类物质,主要在细菌的侵染过程中起作用。分泌毒力因子主要是溶血素、细胞毒性坏死因子等毒素蛋白,主要对宿主细胞产生毒力作用。本文简要综述致肾盂肾炎大肠杆菌毒力因子分泌所需要的5种分泌机制,并论及毒力因子的宏观调控和影响毒力调控的因素。

致肾盂肾炎大肠杆菌特异性片段R049聚集性分布的研究

目的研究致肾盂肾炎大肠杆菌（UPEC）132特异性片段R049在UPEC菌株和正常人粪便分离的大肠杆菌菌株中的分布情况。方法对20株UPEC和40株粪便分离大肠杆菌采用PCR方法扩增R049片段，对R049阳性菌株检测编码5种毒力因子的基因（papC、fimH、hfy、aer、cnfl），并对其基因组DNA用XbaⅠ酶切，进行脉冲场凝胶电泳分析，继而用毛细管法将DNA片段转移至尼龙膜，利用地高辛标记的R049 ORF探针片段进行Southern杂交，分析杂交条带的分布特征。结果20株UPEC中有8株（40％）、40株粪便分离的大肠杆菌中有3株（7．5％）R049片段扩增阳性，两组差异有统计学意义（P〈0．01）。R049阳性菌株中，R049片段与5种UPEC毒力因子密切相关。Southern杂交结果表明3株粪便分离大肠杆菌R049阳性杂交带分别为150kb、15kb与240kb；8株UPEC中有6株阳性杂交带均为350kb，其余2株分别为280kb和25kb。结论UPEC132特异性片段R049在国内分离的UPEC菌株中具有共有性和聚集性分布的特征。

致肾盂肾炎大肠杆菌132特异性基因的筛选

目的 通过抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术，比较致肾盂肾炎大肠杆菌132（UPEC132）与非致病性E．coliK-12MG1655之间基因组的差异，筛选UPEC132特有的基因片段。方法 应用SSH技术构建UPEC132（tester）与非致病性E．coliK-12MG1655（driver）菌株差异DNA消减文库，经PCR和斑点印迹法筛选鉴定阳性克隆，并进行测序及生物信息学分析。结果获得约1600个重组菌的UPEC132消减文库，随机挑取其中的300个克隆，有37个含有UPEC132特异的DNA序列。特异性片段测序后进行生物信息学分析，发现与其相关的37个基因为UPEC132所特有，其中1个为新发现的DNA片段，9个为与致病相关基因，7个为与代谢和物质转运相关基因，2个为与外膜蛋白相关基因，3个为与调节相关基因，10个为未知功能蛋白的基因，其他5个为功能未分类的基因。结论 SSH技术是筛选病原菌特异基因的有效方法，已确定了37个UPEC132的特异基因，为进一步阐明其致病分子机制打下了基础。

致肾盂肾炎大肠杆菌对人肾盂上皮原代细胞黏附的实验研究

目的建立人肾盂上皮原代细胞的培养方法,用于致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)黏附作用的研究。方法利用复合PCR方法检测UPEC 132菌株毒力基因hly和cnfl。采集人肾脏手术标本,利用组织块法取肾盂正常上皮组织,使用添加EGF及BPE的角朊细胞无血清培养基(K-SFM)进行原代细胞培养,经HE染色和免疫细胞化学染色进行鉴定。鉴定符合要求的人肾盂上皮原代细胞用于UPEC黏附试验,分别于不同作用时间观察黏附后细胞形态学变化,并计算黏附率和黏附指数。结果此研究制备的人肾盂上皮原代细胞具备移行上皮细胞特征。带有毒力基因hly和cnfl的UPEC 132菌株作用于人肾盂上皮原代细胞,15 min后细菌开始黏附,120min达到高峰,黏附率为74.4%,黏附指数为34.0。显微镜下观察细胞形变、着色不均,胞浆和胞核都有改变。结论人肾盂上皮原代细胞可用于UPEC的黏附试验,为其致病机理的深入研究奠定基础。

致肾盂肾炎大肠杆菌132的比较蛋白质组学研究

目的研究致肾盂。肾炎大肠杆菌（UPEC）132与UPEC J96及非致病性大肠杆菌K-12MG1655的蛋白质组表达差异。方法采用双向凝胶电泳技术（2-DE）比较UPEC 132、UPEC J96与非致病性大肠杆菌K-12MG1655的菌体蛋白表达图谱差异，差异蛋白用胰蛋白酶进行胶内酶切，肽混合物使用基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱仪（MALDI—TOF—MS）进行质谱分析，将肽质量指纹谱数据输入互联网上的蛋白质数据库进行检索。结果UPEC132识别蛋白点数（466±11）明显高于Ecoli K-12 MG1655（338±15），也高于UPEC J96（382±12）；3菌株共有的蛋白点为298个，2株UPEC共有的蛋白点为56个，UPEC 132特有的蛋白点为89个。MALDI—TOF—MS分析获得UPEC132特异的及显著上调表达的蛋白点22个，涉及毒力因子、物质代谢转运、蛋白合成调节、生物氧化及未知功能的多种蛋白质。结论UPEC菌株与非致病性大肠杆菌间的蛋白质组存在差异，UPEC 132与J96蛋白质组间也有显著不同，为其致病机制的深入研究提供线索。

致肾盂肾炎大肠杆菌毒力因子的基因分布

目的了解致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)毒力因子基因的分布。方法用PCR方法对41株UPEC菌株和40株健康人粪便分离的大肠杆菌进行5种毒力因子基因及新基因R049的扩增检测,并进行对比分析。结果 UPEC组和健康人粪便分离大肠杆菌6种毒力因子基因papC、fimH、hly、cnf1、aer和R049的检出率分别为100%和2.5%,53.66%和5%,63.41%和10%,34.15%和5%,60.98%和35%,40%和7.5%;前者高于后者(P<0.01)。结论 UPEC毒力因子基因分布呈现多态性。