致肾盂肾炎大肠杆菌粘附特性的研究

本文对临床肾盂肾炎病人尿标本中分离的大肠杆菌１３２和１３６的粘附特性进行了系统的研究。受试菌的Ｐ血型阳性红细胞血凝试验阳性，能够与人的尿道上皮细胞粘附。利用致肾盂肾炎大肠杆菌Ｐ菌毛粘附基因群抗血清进行免疫学检测，两株菌的全菌ＥＬＩＳＡ结果阳性，免疫电镜证实该抗血清能与受试菌株的菌毛特异性结合。提取临床分离株的菌毛蛋白进行免疫印迹测定，仅有一条蛋白带显色，其分子量为１６．６ｋｄ。致肾盂肾炎大肠杆菌的粘附特性是区别于其他大肠杆菌的重要特征，上述结果表明本文报告的两株大肠杆菌为致肾盂肾炎大肠杆菌。

P菌毛粘附素在致肾盂肾炎大肠埃希菌对小鼠尿道上行感染中的作用

目的 比较2株具有不同P菌毛粘附素(PapG)的同血清型UPEC和1株无菌毛大肠埃希菌对小鼠泌尿道上行感染性的差异,探讨粘附素在UPEC尿道感染中的作用。方法 通过17PEC尿道内接种形成BALB/c小鼠尿道上行感染;观察尿液、肾脏剖面的菌落计数和肾组织的病理改变。结果 具有P菌毛的UPEC菌株感染之小鼠,在其尿液和肾剖面培养出大量原感染菌,肾组织呈现中、重度急性肾盂肾炎的病理改变;不同P菌毛粘附素的UPEC感染的菌落计数、肾脏病理改变严重度无显著性差异;无菌毛大肠埃希菌感染之小鼠,其尿液和肾剖面只有少量原感染茵生长,肾组织为轻至中度急性炎症改变。结论具有不同粘附素之P菌毛在介导UPEC致小鼠上行性急性肾盂肾炎中均发挥重要作用;无菌毛大肠埃希菌亦可导致小鼠肾脏炎性改变。

致肾盂肾炎大肠埃希菌粘附素重组蛋白诱导小鼠免疫应答

目的获得UPECP菌毛粘附素PapG重组蛋白纯化产物,研究其诱导小鼠的免疫应答,为进一步的PapG疫苗及免疫学研究创造条件。方法GST-PapG重组蛋白经诱导表达和亲和层析纯化后接种于BALB/c小鼠;ELISA法检测小鼠免疫血清的抗体效价,以血凝抑制试验测定其免疫反应性。结果重组蛋白纯化产物可诱导小鼠产生针对PapG粘附素的特异性免疫应答,免疫小鼠血清抗体的效价显著升高,而且具有较强的血凝抑制作用。结论GST-PapG重组蛋白纯化产物具有良好的免疫原性,可用于UPEC抗粘附候选疫苗的筛选和进一步的免疫学研究。

致肾盂肾炎大肠埃希菌132基因组DNA消减文库的构建

目的:应用抑制性消减杂交技术,构建致肾盂肾炎大肠埃希菌132株(UPEC132)与已完成基因组测序的非致病性大肠埃希菌标准株MG1655的基因组DNA消减文库。方法:分别提取UPEC132与MG1655的基因组DNA,经RsaⅠ酶切成为大小200～800bp的片段,一部分与接头连接作为tester,和未与接头连接的酶切片段(driver)进行2次消减杂交及2次抑制性PCR后将产物与pMD18-T载体连接构建DNA消减文库,并转化给大肠埃希菌TOP10构建消减文库。结果:文库扩增后得到139个克隆,经PCR法快速测定,均得到200～800bp的插入片段。结论:所构建的基因组DNA消减文库为进一步筛选UPEC132中与致病相关基因奠定了基础。

致肾盂肾炎大肠埃希菌对细胞的粘附及侵袭

目的:研究致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)132对细胞的粘附和侵袭能力。方法:对比致病菌株UPEC132及无菌毛代表菌株E.coli K-12 p678-54对Vero、Ketr-3及EJ细胞的粘附率、粘附指数和侵袭指数。结果:E.coli K-12p678-54对此3种细胞无粘附无侵袭,而UPEC132对其有明显作用,可致细胞形态明显改变直至死亡。UPEC132对Vero、Ketr-3及EJ细胞的粘附率分别为(61.44±3.21)%、(55.22±4.09)%和(58.67±5.12)%,差别无统计学意义;对3种细胞的粘附指数分别为1.44±0.06、1.74±0.09和2.27±0.18,有显著性差异(P<0.05)。UPEC132对EJ和Ketr-3细胞的侵袭指数分别为(3.25±0.20)×10-3和(3.00±0.34)×10-3,两者之间无统计学差异,但均高于对Vero细胞的侵袭指数[(2.61±0.32)×10-3,P<0.05]。结论:UPEC132对Vero、Ketr-3、EJ细胞均有粘附和侵袭能力,其中对EJ细胞的粘附能力最强,侵袭力也较Vero细胞强,可利用该细胞深入研究UPEC132的毒力及致病机制。

致肾盂肾炎大肠埃希菌新基因R049免疫保护作用的研究

目的克隆和表达致肾盂肾炎大肠埃希菌（UPEC）132新基因R049，研究R049重组蛋白对小鼠的免疫保护作用。方法利用PCR定向克隆方法构建R049基因原核表达系统，表达后通过镍亲和层析纯化获得R049重组蛋白，制备鼠多克隆抗体。重组蛋白与UPEC132全菌蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析，继而R049重组蛋白免疫BALB／c小鼠，用同源菌对小鼠经尿道上行感染，比较免疫组与对照组小鼠尿液与肾脏细菌计数差异。结果成功构建重组株E．coli BL21（DE3）／pET32a-R049ORF，重组蛋白相对分子质量（MT）约为66．9×10^3，纯化后其纯度达到95％，制备多克隆抗体效价为≥1：102400。Western blot证实重组R049蛋白与UPEC132全菌蛋白均能与小鼠抗血清发生特异性反应。动物实验结果表明尿液和肾脏菌落计数在免疫组均明显低于对照组（P〈0．01，P〈0．05）。结论UPEC132的新基因R049具有一定的免疫保护作用，其机制有待进一步研究。

致肾盂肾炎大肠埃希菌对不同细胞感染能力的比较

致肾盂肾炎大肠埃希菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)与尿路上皮细胞之间的相互作用对阐明泌尿道感染的发病机制具有重要意义.本研究利用UPEC132感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、人肾癌细胞(Ketr-3细胞)和膀胱癌细胞(EJ细胞),比较细菌对3种细胞的黏附和侵袭能力.结果表明,UPEC132对上述3种细胞均能黏附与侵袭,其黏附率分别为(49.20±7.55)%,(55.22±4.09)%和(73.20±5.26)%,侵袭指数分别为(2.61±0.32)×10-3,(3.00±0.34)×10-3和(3.25±0.20)×10-3.UPEC132对EJ细胞的黏附率高于另外2种细胞(P<0.05),对EJ细胞的侵袭指数与Ketr-3细胞无显著性差异(P>0.05),但高于Vero细胞(P<0.05).用间接免疫荧光法检测细胞表面P血型抗原物质,表明3种细胞均存在P菌毛受体,以EJ细胞表面的受体分布最多.激光共聚焦显微镜可直接观察到表达绿色荧光蛋白的UPEC132/pSELECT-GFP对EJ细胞的侵袭.由于UPEC132对EJ细胞的黏附能力最强,并直接证明具有侵袭性,因此选择EJ细胞作为研究对象为进一步研究UPEC致病机制奠定基础.

致肾盂肾炎大肠埃希菌毒力的研究

目的了解致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)毒力因子的致病性,为研究UPEC的致病机制奠定基础。方法用PCR方法扩增41株UPEC菌株和40株健康人粪便分离的大肠埃希菌6种毒力因子基因。取24只雌性BALB/c小鼠,随机分为A、B、C 3组,A、B组分别用UPEC J96和E.coli K-12p678-54(无菌毛株)菌液经尿道逆行感染,C组为空白对照,经尿道注入无菌PBS。感染5d后比较3组小鼠尿液和肾脏菌落计数(RCD)以及肾脏组织病理学检查结果。结果PCR检测UPEC和健康人粪便分离大肠埃希菌6种毒力因子基因papC、fimH、hly、cnf1、aer和R049的检出率分别为100%和2.50%,53.66%和5.00%,63.41%和10.00%,34.15%和5.00%,60.98%和35.00%,40.00%和7.50%,差异均有统计学意义(P均<0.01)。A组(UPEC J96感染)小鼠尿液和肾组织培养均有细菌生长(细菌鉴定为papC阳性),菌落计数RCD值绝大多数>3+;B组(E.coli K-12p678-54感染)小鼠中有1只尿液和肾组织细菌培养阳性(细菌鉴定papC阴性),菌落计数为1+。C组(空白对照)小鼠尿道与肾脏均无细菌生长。A组与B组小鼠尿道和肾脏RCD均值(x±s)分别为4.25±0.707、5.75±1.669和0.125±0.354、0.125±0.354,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。病理检查A组有4只小鼠肾组织出现较为明显的炎症变化,B组肾组织未发现明显病变,C组肾组织结构清晰,无病理变化。结论 6种毒力因子与UPEC致病性相关,建立的UPEC感染小鼠模型对UPEC致病机制的研究具有重要意义。