通过随机突变提高抗TNF-α单链抗体的亲和力

目的:提高抗TNFα单链抗体(scFv)的亲和力。方法:应用错配PCR技术在抗TNFαscFv基因中引入随机突变,再通过DNA交换(shuffling)使引入的点突变进一步重排组合,构建突变噬菌体抗体库。采用硫氰酸盐洗脱法对抗体库进行淘筛。挑选活性得到改良的克隆,用斑点ELISA法及硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力的改善。结果:对PCR错配的突变库筛选未得到亲和力明显改善的抗体变种,经DNA交换进一步构建变种库后,筛选获得1个亲和力提高的克隆,其相对亲和指数为1.37mol/L,较亲本抗体的相对亲和指数0.48mol/L有明显提高。结论:通过错配PCR和DNA交换引入随机突变构建抗体库,可有效地提高scFv的亲和力。

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外分子进化

以人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的 5株CDR3突变体为基础 ,利用致错PCR和DNA重排方法对其进行了突变和重排 ,然后克隆重组装的突变单链抗体至载体pHB 1HSCFV而构建了库容为 10 5的抗体库 ,利用噬菌体表面呈现技术对构建的人源化抗体突变库进行了富集 ,并利用单链抗体 -碱性磷酸酶系统进行了阳性克隆的筛选和鉴定。随后以鉴定的 5株阳性克隆为基础进行了第二轮的致错PCR、DNA重排、抗体库的构建和富集 ,并筛选到 4株亲和力较亲本鼠抗体All更好的人源化抗体 ,该研究为研制低免疫原性的导向溶栓制剂奠定基础。

毕赤酵母醇氧化酶1启动子突变体的分离与鉴定

目的:通过醇氧化酶1启动子突变,筛选毕赤酵母高水平表达菌株。方法:通过致错PCR构建醇氧化酶1启动子突变体,经酶切连接到改造过的质粒HSA-pPIC9上,转化毕赤酵母GS115感受态细胞,摇瓶培养表达筛选人血清白蛋白(HSA)高表达突变体菌株。结果:克隆测序结果表明,突变的醇氧化酶1启动子-910和-569位点处共2个碱基发生了T→C突变;获得一株高表达菌株,摇瓶中HSA的表达量由200 mg/L提高到335 mg/L。结论:通过醇氧化酶1启动子突变成功构建了HSA高表达菌株。