草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。

抗菌肽基因转化樱桃矮化砧木获得抗根瘤病的转基因植株

建立了樱桃（PrunuspseudocerasusLindl．）矮化砧木茎尖高频再生系统，并利用根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens（SmithetTownsend）Conn）介导将gus及抗菌肽基因导入樱桃矮化砧木，获得19个转化株系。经Southernblot检测证明，抗菌肽基因已整合到樱桃的基因组。转基因植株接瘤实验、gus基因表达产物的颜色反应及叶片提取液对根癌土壤杆菌C58的抑菌实验表明，抗菌肽基因在转化植株中可能已得到有效表达，试管苗具有明显的抗根瘤病特性。还研究了茎尖分生组织的种质转化特点，结果表明它是一个较好的转化系统，可获得较高的转化频率。

应用基因枪将蚕抗菌肽基因导入水稻获抗白叶枯病株系

将天蚕抗菌肽Ｂ基因应用基因枪法导入水稻发芽种胚，获得转基因植株。经Ｂａｓｔａ抗性鉴定，应用ＰＣＲ技术和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分折表明，抗菌肽Ｂ基因已整合到水稻的基因组。Ｔ３抗白叶枯病株系Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分折证明抗菌肽Ｂ基因在ＲＮＡ水平有表达。

抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达

采用PCR技术改造抗菌肽AD基因 ,将其C末端改造为Asn编码 ,改造后的抗菌肽CecropinAD基因克隆到 pPICZα_A载体上 ,构建成酵母重组分泌型表达载体 ,转化毕赤酵母 (Pichiapastoris)受体菌GS115中 .采用zerocin抗性标记筛选重组转化子 ,经摇瓶发酵 ,浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测 .结果表明 ,改造后的CecropinAD基因在毕赤酵母中获得了表达 ,表达产物经α_Factor信号肽引导分泌到胞外 ,具有较强的杀菌活性 .

樱桃砧木叶片再生系统建立及抗菌肽基因转化

以优良樱桃砧木新品系 98 1、Colt、大青叶为试材进行叶片离体再生及根癌农杆菌介导遗传转化 ,建立了高频率再生系统 ,并获得抗菌肽转基因植株。诱导叶片再生的最佳培养基为MS附加BA 1.0～2 .0mg/L、NAA 0 .3～ 0 .5mg/L、GA 0 .5mg/L、AgNO3 5 .0～ 10 .0mg/L。农杆菌及受体感受态是影响转化的关键 ,延迟筛选可提高叶片中转化细胞对卡那霉素的抗性而利于再生。PCR及SouthernBlot检测为阳性 ,表明抗菌肽基因已整合到樱桃砧木 98 1基因组。

农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入烟草的研究

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能,对烟草等茄科作物的青枯病假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)具有较强的杀菌效果。人工合成抗菌肽基因(122 bp)转入根癌农杆菌(Agrobnctcrium tumefaciena),感染烟草叶盘,诱导成苗。通过对卡那霉素敏感筛选,胭脂碱脱氢酶检定及抗菌肽片段探针杂交,确认抗菌肽基因已转入烟草。现正研究其在烟草中表达及抗青枯病的可能性。

家蝇生长发育各阶段抗菌肽基因表达情况的研究

目的从基因角度分析家蝇生长发育各阶段抗菌肽的表达情况。方法制备家蝇卵以及Ⅰ龄、Ⅱ龄、Ⅲ龄幼虫、蛹和成虫等6个生长阶段的总RNA,采用半定量RT-PCR技术,以磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)基因作为内参照,根据GenBank公布的家蝇抗菌肽基因-天蚕素(cecropin)基因、防御素(defensin)基因和攻击素(attacin)基因的核苷酸序列设计特异性引物进行RT-PCR扩增,分析家蝇生长发育各阶段抗菌肽基因mRNA表达量。结果上述6个生长发育阶段均检测到cecropin、defensin和attacin等3种抗菌肽基因的表达,分别在210、300和650bp出现一条带,与其理论值相符。其中Ⅲ龄幼虫期和成虫期抗菌肽基因mRNA的表达量最高(3种抗菌肽基因电泳图谱扫描光密度与内参基因GAPDH光密度的比值分别为1.61、1.99和1.62,1.47、1.92和1.59),卵期、Ⅰ龄幼虫期和蛹期表达量相对较低(3种抗菌肽基因电泳图谱扫描光密度与内参基因GAPDH光密度的比值分别为0.49、0.49和0.42,0.72、0.49和0.64,0.65、0.39和0.91)。结论家蝇抗菌肽基因在不同发育阶段均普遍表达,但表达水平存在明显差异。

抗菌肽AD基因的合成

设计并合成了一种新型抗菌肽基因，合成的抗菌肽（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）ＡＤ基因全长１４０个碱基对，克隆于ｐＣＲＴＭ２１载体上，经ＤＮＡ序列分析证实，合成的ｃｅｃｒｏｐｉｎＡＤ基因的碱基序列与设计序列完全一致．

家蚕抗菌肽基因研究进展

抗菌肽是昆虫先天性免疫系统中十分重要的效应因子,近年来一直是昆虫免疫学研究的热点。家蚕作为鳞翅目昆虫的代表,其抗菌肽研究取得了长足进展。根据已经研究获得的抗菌肽基因序列在家蚕基因组中进行同源搜寻,共获得了40个家蚕抗菌肽基因。这些基因编码的多肽在大小、氨基酸组成和性质上差异很大,但基于结构性质可以分成3类:(1)具有α-螺旋结构并且缺乏半胱氨酸(cysteine,Cys)的线性抗菌肽;(2)富含脯氨酸或甘氨酸的组成性抗菌肽;(3)富含半胱氨酸的环形抗菌肽。以这3类结构作为主线,综述了家蚕抗菌肽近年来的研究进展。

抗菌肽基因导入桑树获得抗病转基因植株

用携带抗菌肽基因的农杆菌处理桑子叶，在含有羧苄青霉素（Cb）400～500mg／L和卡那霉素（Km）20mg／L的MS培养基上，有32.4％的子叶产生了不定芽；66.5％的不定芽在含有Cb300mg／L和Km30～40mg／L的培养基中,正常生长成2～3cm高的新稍；新梢在含Cb50mg／L和Km10mg／L的生根培养基中有72．6％形成完整根系。3次转化共获得12个株系55株KmR植株。不同株系桑苗叶片DNA点杂交分析显示，7个株系有阳性杂交信号。KmR株系桑苗的抗病性测定显示，5个株系共14株桑苗对青枯病具有较强抗性.

天蚕抗菌肽A与蜂毒素杂合肽基因的合成及在大肠杆菌中的克隆与表达

根据天蚕抗菌肽A(cecropinA ,CA)N端第 1～ 7个氨基酸残基、蜂毒素 (melittin ,M )N端第 5～ 12个氨基酸残基 ,以大肠杆菌偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA(1～ 7) -M(5～ 12 )基因 ,同载体 pGEMEX - 1连接后转化大肠杆菌JM 10 9,经打点杂交筛选和序列测定 ,获得一个与设计一致的克隆。将此克隆中的质粒亚克隆至JM10 3(DE3) ,经IPTG诱导、BrCN切割和抑菌圈试验表明 ,克隆的杂合肽基因在JM 10 9(DE3)中获得了表达。

东海贻贝抗菌肽Myticin A基因的克隆表达及其生物学活性

目的:在毕赤酵母表达系统中表达贻贝抗菌肽Myticin A并检测其生物学活性。方法:提取贻贝总mRNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增得到DNA片段。PCR产物与pMD18 T连接,得到阳性重组载体pMD18 Myticin A。Myticin A基因插入载体pPIC9K中,得到的重组载体pPIC9K Myticin A转化至宿主菌中。得到高抗性阳性菌株并进行诱导表达。发酵上清进行Tricine SDS PAGE分析并用CM sepharose柱和Sephadex G 25柱纯化,Western印迹法鉴定并检测生物学活性。结果:获得重组载体pPIC9K Myticin A。高抗性多拷贝阳性表达菌株GS115/pPIC9K Myticin A经甲醇诱导后,Tricine SDS PAGE证实其相对分子质量为4 500,表达量为14%以上,纯化后纯度达到90%以上。Western印迹法证实所表达样品为Myticin A。表达样品对巨大芽胞杆菌的生长有抑制作用,对小鼠成纤维细胞(L929)、胰腺癌细胞(SW1990)、结肠腺癌细胞(LoVo)的生长均有明显抑制作用。结论:应用毕赤酵母表达系统能较好地表达抗菌肽Myticin A,生物学活性研究证实其具有抗革兰阳性菌作用,明显抑制肿瘤细胞生长。

转抗菌肽B基因和bar基因籼稻植株的再生

运用基因枪法将含有 bar基因和 cecropin B基因的质粒 p CB1导入籼稻品种特青的幼胚细胞 ,筛选后得到 3株转基因植株。PCR检测和 Southern杂交结果表明 ,外源基因已整合到水稻基因组中。转化当代植株表现出对 Basta很强的抗性 。

天蚕抗菌肽B基因的化学合成及克隆

用化学合成法,我们设计、合成了一个以植物偏爱的遗传密码子编码的天蚕抗菌肽B基因。通过把该基因与M13mp19噬菌体载体重组、克隆;转化大肠杆菌JM103,杂交检测和序列测定,得到二个与设计一致的克隆。

新型抗菌肽基因设计、合成及其在酵母中的表达(Ⅰ)——杂合抗菌肽基因的设计与合成

以化学合成并证实抗菌活性和抗菌谱都高于天然抗菌肽的杂合肽ＣｅｃｒｏｐｉｎＡ１－１１Ｄ１２－３７的氨基酸序列为基础，选用酵母高频使用密码子设计了一种新型抗菌肽基因，基因合成采用二次ＰＣＲ（聚合酶链式扩增）方法．设计和合成的基因全长１４０个碱基对，包括氨基酸编码序列、起始密码子、终止密码子和两端限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ识别顺序，合成的基因克隆于ＰＣＲＴＭ２．１载体上．经ＤＮＡ序列分析证实，合成基因碱基序列与设计序列完全一致．

Magainin和cecA-mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

选用毕赤酵母偏爱密码子 ,设计合成了新型抗菌肽基因。所合成的magainin基因和cecA mil杂合肽基因全长分别为 1 0 1bp和 60bp ,并在其N端引入kex2裂解位点 ,以保证表达抗菌肽具有天然N端。其中 ,cecA mil杂合肽基因根据cecropinAN端第 1～ 7个氨基酸残基、melittinN端第 5～ 1 2个氨基酸残基所设计合成。基因分别克隆入pPICZα A质粒 ,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα A mag和pPICZα A CM。在AOX1 (醇氧化酶 )启动子调控下 ,类似天然抗菌肽大小的magainin及cecA mil蛋白获得分泌表达 ,其表达量分别为 1 0 5mg L和 1 1 8mg L。初步抑菌活性测定 ,显示两者对金黄色葡萄球菌及E .coliDH5α有较好的抑杀活性。

家蝇抗菌肽Attacin-2基因的克隆、序列分析和诱导表达

攻击素(attacin)作为昆虫抗菌肽之一,在昆虫的先天免疫中起着重要作用。本研究通过家蝇Musca domesticaEST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇的Attacin-2基因(Mdatta2)cDNA序列。其全长819 bp,包含一个726 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),以及42 bp的5'末端非翻译区(5'UTR)和51 bp的3'末端非翻译区(3'UTR),编码241个氨基酸残基,推导的多肽N端22个氨基酸残基为信号肽序列。同源性分析表明,其氨基酸序列与嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的Attacin一致性最高(46%)。以邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建的系统关系表明,家蝇的Attacin-2与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先,属于Attain_C超家族。应用实时荧光定量PCR的方法研究家蝇幼虫在受到外源细菌刺激时Mdatta2基因的表达,结果显示,在大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus分别刺激后3 h和6 h,家蝇幼虫Mdatta2表达量出现显著上调。Mdatta2基因在家蝇幼虫体内呈诱导型表达,表达水平随诱导时间的不同而变化,提示Mdatta2基因可能在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。

抗菌肽Magainin基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽magainin基因片段 ,合成片段拼接后 ,与pUC19重组 ,获得magainin基因 .Magainin基因与酵母表达载体pPIC3重组 ,构建胞内表达载体pPIC3 Mag ,电击法转化GS115宿主菌 ,经表型筛选和PCR鉴定证实了目的基因已稳定整合入Pichiapastoris酵母基因组中 .阳性克隆用甲醇诱导表达 ,用免疫印迹法确定了产物的正确性 .

Cecropin B抗菌肽基因的定向诱变与表达

采用寡核苷酸介导的定向点突变法，对天蚕抗菌肽Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ基因１３ 位甲硫氨酸（ Ｍｅｔ） 诱变为亮氨酸（Ｌｅｕ） 或缬氨酸（Ｖａｌ） ，保留１ 位上的Ｍｅｔ，诱变后的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＢＤＮＡ序列分析证明产生了预期的点突变。将Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ 突变体基因与ｐＧＥＸ４Ｔ２ 融合表达载体中的谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ） 基因融合，在Ｅ．ｃｏｌｉ 中表达，当ＩＰＴＧ 诱导３０ｍｉｎ 后，工程菌的数量开始减少，然后逐渐恢复正常。说明Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ 突变体与ＧＳＴ 基因融合表达后仍然具有很强杀伤原核细胞的作用。

双价抗菌肽基因转化辣椒

在建立高效快速辣椒（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ，）子叶离体培养和植株再生体系的基础上，将昆虫抗菌肽Ｂ、Ｄ基因构建而成的双价质粒ｐＣＤＢ－ＩＩ以农杆菌为介导转入５个辣椒栽培品种，共获得ＫａｎＲ植株１２００多株，对部分ＫａｎＲ植株进行点杂交、ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测，结果证明了外源基因被成功整合。盆栽接青枯菌试验，结果显示，转基因植株具有较强的抗病力。