胃癌组织P27、MMP-9和PEDF蛋白表达及意义

目的:探讨P27、MMP-9和PEDF蛋白表达在胃癌发生发展中的作用。方法:应用免疫组织化学法检测82例人体胃癌组织标本中胃癌细胞内P27、MMP-9和PEDF的表达;统计学分析上述各分子标记物与胃癌临床病理因素间的关系。结果:(1)82例正常胃黏膜均有P27、PEDF表达,在胃癌组织中的表达率分别为48%和43%。MMP-9在胃癌中表达率为70%,正常胃黏膜呈阴性表达。(2)P27低表达与胃癌组织学分级和远处转移有关(P<0.05);MMP-9高表达与浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关(P<0.05);PEDF低表达与组织学分级、浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关(P<0.05)。结论:胃黏膜上皮细胞在癌变过程中P27和PEDF表达降低,而MMP-9表达升高;MMP-9在胃癌侵袭转移中起促进作用,P27和PEDF可抑制胃癌的进展。

Maspin蛋白在乳腺癌中的表达和意义

目的:探讨M asp in蛋白在不同病理类型的乳腺癌中的表达特点和意义。方法:采用免疫组化M axv is ion法检测不同类型乳腺癌M asp in蛋白表达状况,同时分析乳腺导管癌、浸润性小叶癌中M asp in蛋白表达与ER、PR、C-erbB-2、VEGF、M VD及淋巴结转移的关系。结果:M asp in在导管原位癌、非特殊类型浸润性导管癌及浸润性小叶癌中的阳性表达率差异无显著性(P>0.05)。小管癌与髓样癌中未发现M asp in蛋白表达。在乳腺导管癌中,M asp in阴性组C-erbB-2表达、M VD值明显比M asp in阳性组高(P<0.05)。结论:M asp in蛋白可能通过抑制微血管生成来发挥抑癌作用。

子宫颈鳞状细胞癌复发患者血清鳞状细胞癌抗原监测的意义

目的探讨血清鳞状细胞癌抗原（SCCAg）在监测宫颈鳞癌患者复发中的意义。方法对1999-2005年收治的72例宫颈鳞癌复发患者血清SCCAg水平与诊断、预后的关系进行单因素和多因素分析。结果72例复发患者中，术后复发30例、放化疗后复发42例，其中血清SCCAg水平升高者61例（占85％）。此61例患者中，20例在随诊中首先出现血清SCCAg水平升高而临床及影像学检查未发现肿瘤，血清SCCAg水平提前升高的中位时间为3个月，平均4．6个月（1～13个月）。72例复发患者中，45例患者无任何临床症状，仅因血清SCCAg水平升高或常规随诊发现复发；27例患者有症状，其中单侧下肢水肿或疼痛15例，阴道不规则流血7例，出现远处转移相关症状5例。细胞或组织病理学检查诊断复发者33例；临床及影像学检查结合血清SCCAg水平诊断复发者39例，其中29例仅依靠血清SCCAg水平升高及影像学检查即诊断复发。72例复发患者的中位生存时间为11个月，平均生存时间为23个月（2～62个月），总的3年生存率为25％，5年生存率为19％。单因素分析发现，初治前患者血清SCCAg水平、病理分级、复发部位、复发后治疗方式以及复发时、复发后治疗中、治疗后血清SCCAg水平对患者的3年生存率有明显影响（P〈0．01）；但20例血清SCCAg水平提前出现升高的患者与52例血清SCCAg水平未提前升高的患者相比，3年生存率分别为22％、27％，差异无统计学意义（P=0．5761）。多因素分析发现，复发患者仅病理分级、复发后的治疗方式是独立的预后影响因素（P〈0．05）；而复发部位及各种血清SCCAg状态不是独立的预后影响因素（P〉0．05）。结论血清SCCAg水平监测在宫颈鳞癌复发患者中的诊断及其对预后的判断中有一定的价值。

胎盘组织中色素上皮衍生因子蛋白的表达变化与子痫前期发病的关系

目的 探讨胎盘组织中色素上皮衍生因子（PEDF）蛋白表达及其与胎盘血管生成的机制在子痫前期发病中的作用.方法 选取2011年10月至2013年1月在南方医科大学南方医院妇产科住院分娩的子痫前期孕妇60例,分为子痫前期轻度组30例,子痫前期重度组30例；同期分娩的健康妊娠晚期孕妇40例作为对照组.采用蛋白印迹和免疫组化SP法测定各组孕妇胎盘组织中PEDF蛋白的表达,计数胎盘微血管密度（MVD）,对胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD进行相关性分析.结果 （1）胎盘病理：子痫前期轻度组和重度组胎盘重量明显减轻,绒毛血管数量减少,管腔狭窄,滋养细胞基底膜增厚；合体滋养细胞结节状增生,伴灶性梗死、纤维素样坏死或血栓形成.而对照组胎盘组织则无上述病理改变.（2） PEDF蛋白表达：子痫前期轻度组、子痫前期重度组和对照组胎盘PEDF蛋白表达水平分别为0.63 ±0.09、0.93±0.07和0.47 ±0.04,子痫前期轻度组及子痫前期重度组胎盘PEDF蛋白表达水平显著高于对照组,分别比较,差异有统计学意义（P＜0.05）；且子痫前期重度组显著高于子痫前期轻度组,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.（3）MVD检测：子痫前期轻度组、子痫前期重度组和对照组胎盘组织中MVD水平分别为106 ±9、93 ±8、136 ±9,子痫前期轻度组及重度组显著低于对照组,分别比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,且子痫前期重度组显著低于子痫前期轻度组,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.（4）相关性分析：子痫前期轻度组及子痫前期重度组胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD均呈负相关（分别为r=-0.426,P ＜0.05;r=-0.646,P＜0.05）,对照组胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD也呈负相关（r=-0.589,P＜0.05）.结论 子痫前期孕妇胎盘组织中PEDF蛋白高表达,导致胎盘血管生成障碍和胎盘发生缺血缺氧性病理改变,从而参与子痫前期的发病与病情进展.

高氧诱导小鼠视网膜病变模型中血管内皮生长因子和色素上皮衍生因子的表达及意义

目的研究高氧诱导小鼠视网膜病变模型中血管内皮生长因子（VEGF）和色素上皮衍生因子（PEDF）的表达和意义，并探讨两者在视网膜新生血管形成过程中的作用。方法对照实验研究。对新生C57BL-6N系小鼠给予高氧后，置相对低氧环境中饲养，诱导产生视网膜新生血管。在小鼠生后第12、14及17天摘除眼球，通过逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法及荧光素灌注造影，分别检测不同时间点全视网膜新生血管组织对VEGF与PEDF的mRNA和蛋白质的表达水平的差异，并观察视网膜新生血管的分布与形态变化，通过血管内皮细胞计数对新生血管进行量化。应用SPSS11．5统计学软件，采用析因设计方差分析，分别比较实验组与对照组mRNA与蛋白质表达水平的差异，以P〈0．05作为差异有统计学意义。结果在高氧环境中（出生第12天小鼠），OIR模型鼠VEGF蛋白质表达A值（0．47±0．12）较正常鼠（1．81±050）下降，PEDF蛋白质表达A值（5．35±0．94）较正常鼠（0．68±0．17）明显升高；而相对低氧环境中（出生第14和17天小鼠），VEGF蛋白质表达A值（2．15±0．46，5．49±0．97）较正常鼠（0．90±0．05，0．88±0．91）明显升高，PEDF蛋白质表达A值（2．07±0．35，1．37±0．48）较正常鼠（2．62±0．68，5．30±0．59）明显下降，尤以第17天下降显著。对不同时间点VEGF和PEDF蛋白质表达水平进行析因方差分析，结果显示各时间点的VEGF蛋白质表达水平差异有统计学意义（F=70．450，P=0．000），各时间点的PEDF蛋白质表达水平差异有统计学意义（F=160．237，P=0．000）。出生第12、14及17天小鼠视网膜VEGF蛋白质的表达与正常对照组比较，差异有统计学意义（P=0．009，0．010，0．000），PEDF蛋白质的表达差异也有统计学意义（P=0．002，0．046，0．000）；出生第12、14及17天小鼠视网膜VEGF mRNA的表达与正常对照组比较，差异有统计学意义（P=0．001，0．000，0．001），PEDF mRNA的表达差异也有统计学意义（P=0．000，0．001，0．000）。伴随着视网膜组织的缺氧，出现了VEGF蛋白质表达水平升高和PEDF蛋白质表达水平降低，导致视网膜组织中VEGF与PEDF蛋白质表达失衡；VEGF与PEDF的mRNA表达亦发生类似变化，且较蛋白质改变提前发生。上述改变均伴随着同期视网膜新生血管的发生、发展及其严重程度而逐渐加重。结论VEGF和PEDF的mRNA和蛋白质表达失衡可能是造成视网膜新生血管发生的机制之一。

重组AAV2-色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞增殖的影响

目的 体外培养人视网膜微血管内皮细胞,探讨重组rAAV2-色素上皮衍生因子（PEDF）对该细胞在不同氧环境下增殖的影响.方法 实验研究.2%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶消化视网膜,获得视网膜微血管内皮细胞;接种于预先包被纤维连接蛋白的培养瓶内,用含10%胎牛血清、内皮细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加物的内皮细胞培养基,置于5%CO237 ℃培养箱内培养.相差显微镜观察细胞形态及生长情况.抗第Ⅷ因子相关抗原抗体鉴定内皮细胞.以125 μmol/L CoCl2建立HRCECs化学低氧模型,观察低氧对内皮细胞增殖的影响.按照105病毒基因组数/细胞的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共焦显微镜下观察EGFP阳性细胞,免疫印迹法检测PEDF蛋白表达.MTT法测定rAAV2-PEDF对不同氧条件下对细胞增殖的影响.流式细胞仪检测rAAV2-PEDF对不同氧条件下对细胞凋亡的影响.两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用方差分析.结果 原代培养的人视网膜微血管内皮细胞48～72 h贴壁,2周左右细胞融合.第Ⅷ因子相关抗原鉴定细胞呈阳性.转染病毒48 h后,激光共焦显微镜下观察可见EGFP阳性细胞,免疫印迹法检测,实验组PEDF表达明显强于其他组.MTT结果显示,单纯低氧处理,正常对照组A值为0.085±0.021,实验组A值为0.166±0.024（t=3.938,P＜0.05）.rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,A值分别为：正常对照组0.171±0.011,rAAV2-EGFP组0.178±0.016,rAAV2-PEDF组0.169±0.017（F=0.01,P＞0.05）.rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,A值分别为：单纯CoCl2组0.166±0.013,CoCl2＋rAAV2-EGFP组0.155±0.012,CoCl2＋rAAV2-PEDF组0.116±0.015（F=6.25,3.50;P＜0.05）.rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.3%,rAAV2-EGFP组为3.3%,rAAV2-PEDF组为1.7%.rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,单纯CoCl2组凋亡细胞比例为3.6%,CoCl2＋rAAV2-EGFP组为6.7%,CoCl2＋rAAV2-PEDF组为36.4%.结论 rAAV2-PEDF转染人视网膜微血管内皮细胞后PEDF可稳定表达,并能显著抑制低氧诱导下内皮细胞的增殖.

烟曲霉菌诱导大鼠呼吸道上皮细胞IKKα调控maspin蛋白表达的初步研究

目的研究烟曲霉诱导大鼠呼吸道上皮细胞时是否存在IkB激酶-α（IKBkinase-α，IKKα）调控maspin蛋白表达下调。方法体外培养大鼠呼吸道上皮细胞（ratbronchialepithelialcells，REC），制备灭活的烟曲霉菌菌丝（Aspergillusfumigatushyphae，AFH）悬液诱导REC细胞，以磷酸盐缓冲液（PBS）为对照，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测REC中maspin基因的表达，并通过免疫细胞化学技术观察maspin蛋白及IKKα在REC的表达情况。进一步制备浓度依次增高的AFHl—3悬液诱导REC细胞，WesternBlot技术检测REC的maspin和IKKα蛋白表达。采用SPSS13．0软件进行方差分析和两变量的相关性分析。结果RT—PCR检测显示AFH组与对照组的maspin蛋白的mRNA相对表达量分别为0．128±0．059和2．972±0．353，差异具有统计学意义（t=15．883P〈0．05）。免疫细胞化学结果显示，maspin蛋白在两组中均表达，其中AFH组呈弱阳性，而对照组呈中度阳性，综合计分两组差异有统计学意义（t=3．721P〈0．05）；IKKα显色在AFH组中度阳性，在对照组弱阳性，综合计分差异有统计学意义（t=6．825P〈0．05）。WesternBlot结果maspin与B—actin的灰度比值对照组为0．912±0．023，AFHl—3组分别为0．607±0．030、0．476±0．019、0．416±0．017，组间差异有统计学意义（F=281．91，P〈0．05），且任意两组比较差异均有统计学意义；IKKα与β-actin灰度比值对照组为0．624±0．012，AFHl—3组分别为0．739±0．020、0．778±0．010、0．927±0．017，组间差异有统计学意义（F=200．91，P〈0．05），且任意两组比较差异均有统计学意义。两变量相关性分析结果显示，maspin蛋白表达与IKKα蛋白表达呈负相关关系（r=-0．911，P〈0．05）。结论AFH诱导大鼠REC中IKKα表达上调并伴有maspin蛋白表达下调。

PEDF基因修饰人脐带间充质干细胞对糖尿病大鼠视网膜的保护作用

目的 探讨色素上皮衍生因子（PEDF）基因修饰的人脐带间充质干细胞（hUCMSC）对糖尿病视网膜病变（DR）大鼠视网膜的保护作用.方法 实验研究.采用慢病毒包装的PEDF-MSC-绿色荧光蛋白（GFP）质粒和GFP-间充质干细胞（MSC）质粒转染hUCMSC,并测量PEDF及VEGF的表达.成年SD大鼠50只采用随机数字表法随机分为5个组：正常对照组（A组）、DR对照组（B组）、磷酸盐缓冲液（PBS）治疗组（C组）、GFP-MSC治疗组（D组）及PEDF-MSC治疗组（E组）,各组均为10只大鼠.选取链脲佐菌素（STZ）腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型,造模成功后4个月进行干预治疗,D组与E组分别给予玻璃体腔注射GFP-MSC和PEDF-MSC,C组给予玻璃体腔注射PBS,A组与B组不予特殊治疗.干预后8周行HE染色观察视网膜内丛状层、内核层及外核层,并进行厚度测量,免疫组织化学染色观察视网膜PEDF和VEGF阳性染色情况,实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测大鼠视网膜PEDF和VEGF mRNA的表达变化.计量数据均符合正态分布.两组数据间比较采用独立样本t检验;组间的数据采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验,两个变量之间相关性分析采用Pearson相关性检验.结果 胰蛋白酶消化法获取的hUCMSC表达CD105、CD73和CD90,不表达CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR.ELISA检测结果显示,PEDF-MSC-GFP的PEDF（84.09±7.07） μg/L较GFP-MSC （9.03±0.14） μg/L表达增高,差异均有统计学意义（P〈0.05）,而VEGF表达差异无统计学意义（P〉0.05）.视网膜厚度测量分析结果显示：玻璃体腔注射后2个月,E组内丛状层厚度显著下降,内核层与外核层厚度显著增加（P〈0.05）.玻璃体腔注射后2周,荧光显微镜下观察到D组与E组大鼠玻璃体腔内放射状及簇状排列的绿色荧光,视网膜中未发现明显绿色荧光.免疫组织化学法染色结果显示：治疗后2个月,E组PEDF平均A值增加;VEGF平均A值下降（P〈0.05）.RT-PCR结果显示：治疗后2个月,E组PEDF mRNA表达水平增加.VEGF mRNA表达水平下降（P〈0.05）.结论 玻璃体腔注射PEDF-MSC能上调早期糖尿病大鼠视网膜PEDF表达与下调VEGF表达,改善DR大鼠神经视网膜损伤.

色素上皮细胞衍生因子对脑胶质瘤细胞凋亡的影响

目的 本研究试图通过检测人脑胶质瘤U87细胞中色素上皮细胞衍生因子（PEDF）以及凋亡相关蛋白的表达，探讨其表达在胶质瘤的增殖和细胞凋亡调控中的作用。方法将100μg/ml的PEDF加入U87细胞中（PEDF处理组），同时以未加PEDF蛋白的胶质瘤细胞作对照组（U87con），采用四甲基偶氮唑蓝法检测PEDF对胶质瘤细胞U87增殖率的影响；流式细胞术检测胶质瘤细胞是否凋亡；Western-blot（免疫印迹）检测PEDF处理组凋亡相关蛋白p16的变化。结果 实验数据显示：与对照组相比，当PEDF浓度为100μg/ml时，对U87的抑制率为（54．29±0．62）％，PEDF处理组胶质瘤细胞的增殖明显减慢（t=2．63，P〈0．05）；PEDF处理过的凋亡细胞产生明显增多，annexin V^＋和PI-的细胞为（21．84±0．36）％，提示胶质瘤细胞处于凋亡早期（t=2．86，P〈0．05）；PEDF诱导的发生凋亡的胶质瘤细胞中，p16蛋白的表达量明显增加（0．82±0．09），与对照组相比（0．43±0．03），差异具有统计学意义。结论 PEDF与p16协同作用，可能在胶质瘤细胞凋亡的调控中起着重要的作用，从而抑制胶质瘤细胞增殖。

腺病毒介导的色素上皮衍生因子抑制大鼠脉络膜新生血管的研究

目的 探讨腺病毒介导的色素上皮衍生因子（AdPEDF）对大鼠脉络膜新生血管（CNV）的抑制作用。方法 实验研究。选取6～8周雌性BN大鼠68只（136只眼），CNV模型建立后，采用单纯随机抽样方法将68只大鼠随机分为5组，空白对照组（N组）4只大鼠（8只眼），其余64只大鼠（128只眼）作为实验组。根据给药方式不同将实验组随机分为玻璃体腔注射实验组（A组）、玻璃体腔注射对照组（B组）、球周注射实验组（C组）、球周注射对照组（D组）。A组玻璃体腔注射AdPEDF1μl；B组玻璃体腔注射腺病毒载体注射液（AdNull）1μl；C组球周注射AdPEDF1山；D组球周注射AdNull1μl。于给药后3、7、14及28d行组织病理、TUNEL染色、荧光素眼底血管造影（FFA）检查、及CNV中央最大厚度测量。应用SPSS11．5统计学软件对光凝斑荧光素渗漏行秩和检验；对CNV发生率行X^2检验；对CNV中央最大厚度行单因素与析因方差分析。结果 A组（54．7％）和C组（56．3％）给药后比给药前荧光素渗漏减轻（t=2．75，3．15；P〈0．01）。给药后7d，A组（57．3％）、C组（57．8％）CNV数量减少；B、D组CNV呈显著纤维血管增殖。给药后A、C组CNV中央最大厚度分别为（44．51±0．53）和（44．37±0．48）μm，较N组减小（F：7．57，8．85；P〈0．01），并且随时间延长而减小（F=4．31，5．25；P〈0．05）。给药后3dA组CNV中央最大厚度为（46．35±0．62）μm，比C组（44．90±0．44）μm大（F=3．55，P〈0．05）；给药后14及28d，A组CNV中央最大厚度比C组减少（F=6．54，P〈0．01；F=4．41，P〈0．05）。给药后A、C组CNV内皮细胞出现部分TUNEL阳性细胞。术后并发症为白内障（5只眼）。结论 AdPEDF对BN大鼠CNV有抑制作用，治疗后7d起效，14d抑制作用最强，可持续至28d。玻璃体腔注射比球周注射起效慢，但抑制作用强。

色素上皮衍生因子及其治疗视网膜新生血管性疾病的研究进展

视网膜新生血管（RNV）是目前最主要的致盲病因之一，迄今为止，尚无特效治愈方法。色素上皮衍生因子（PEDF）是新近发现的一种有效的眼内新生血管天然抑制剂，对新生血管的形成和发展起着重要的调控作用。有研究结果表明，应用PEDF重组蛋白或PEDF的眼内基因转移可以显著抑制RNV的形成，这为糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变及视网膜中央静脉阻塞等视网膜新生血管性疾病的治疗开辟了崭新的途径。因此，有必要就PEDF的生物学概况、对新生血管抑制作用的特点和机制及其在视网膜新生血管防治中的应用前景进行综述。（中华眼科杂志，2007，43：1043．1047）

色素上皮衍生因子对新生小鼠视网膜病变新生血管的抑制作用

目的探讨色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)对高氧诱导的新生小鼠视网膜病变新生血管的抑制作用。方法选取7日龄C57BL/6J新生小鼠吸75%高氧5d后返回空气制备早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity,ROP)的小鼠模型。通过对模型组(n=26)和模型对照组(n=26)小鼠视网膜比较,观察吸氧对视网膜血管的影响。治疗组(n=112):采用不同剂量和注药次数给ROP小鼠右眼玻璃体内注入PEDF,左眼作为自身对照,在生后17d各组取材做视网膜铺片和切片,对视网膜新生血管进行形态学观察和定量研究。结果ROP小鼠在生后第12天和14天右眼注入两次PEDF后,第17天时计数突破视网膜内界膜的细胞核数,1μg组左右眼细胞核数分别是(39.43±3.28)个和(13.51±2.05)个(P=0.000);2μg组左右眼细胞核数分别是(48.40±6.24)个和(11.80±1.74)个(P=0.000)。血管形态和定量结果均显示眼内注射PEDF后新生血管形成明显减少。以2μg作为注射PEDF剂量,单次注药无效,二次和三次眼内注药有效果。结论玻璃体内注入PEDF能有效抑制视网膜新生血管的生长,同时不影响正常血管的发育,可能成为防治ROP有效的血管抑制因子。

色素上皮衍生因子治疗年龄相关性黄斑变性的研究进展

年龄相关性黄斑变性（AMD）是世界范围内老年人致盲的主要疾病之一，探索治疗AMD的有效方法具有防盲治盲的重要意义。色素上皮衍生因子（PEDF）是最强效的内源性新生血管抑制剂，大量基础研究及Ⅰ期临床试验的结果表明，PEDF可有效治疗以脉络膜新生血管形成为主要特征的湿性AMD，因此，PEDF已成为目前最具潜能的治疗AMD的首选药物之一。

色素上皮源性生长因子在低压性缺氧成年大鼠视网膜的表达

目的探讨成年大鼠在低压性缺氧后，色素上皮源性生长因子在其视网膜的表达情况。方法成年Wistar大鼠48只随机分成6组，每组8只，其中正常对照组8只，其余5组在暴露于低氧环境（氧气体积分数为7％～9％）2h后，分别于3h、24h、3d、7d和14d，通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应，蛋白免疫印迹法和免疫组化的方法检测色素上皮源性生长因子（PEDF）在视网膜的表达情况。结果免疫组化显示PEDF在正常及缺氧组大鼠视网膜神经节细胞层、内网层、外网层、内核层和光感受器层有表达；在暴露于低氧性环境后的3h、24h、3d、7d和14d，成年大鼠视网膜PEDF mRNA水平与正常对照组相比，分别减少17．3％、28％、44％、46％和51％（P值均〈0．05）；PEDF蛋白质水平较正常对照组分别减少了21．6％、37．3％、39．8％、42．6％、43．9％（P值均〈0．05）。结论：这次实验结果表明缺氧可以使成年大鼠视网膜PEDF的表达下调。

脂质体介导色素上皮衍生因子-绿色荧光蛋白质粒转染大鼠视网膜细胞及其转染途径的实验研究

目的观察表达质粒色素上皮衍生因子（PEDF）-绿色荧光蛋白（GFP）以脂质体介导转染入BN大鼠视网膜组织的表达及定位，探索合适的基因治疗给药方法。方法将脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP分别经玻璃体注射和视网膜下注射的途径转染至BN大鼠眼内，于一定时间内分别用荧光显微镜观察GFP表达情况，用RT—PCR方法检测PEDF表达情况。结果（1）BN大鼠视网膜下注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后1d即可见在荧光显微镜下观察到在注射点周围明显的绿色荧光蛋白分布于视网膜全层包括RPE细胞层，第2、3周荧光强度比第1周增强，荧光范围也有所扩大，可以持续表达4周。RT—PCR结果证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。（2）经玻璃体腔注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后第1天BN大鼠的视网膜和RPE细胞亦可见绿色荧光蛋白表达，且分布更均匀，范围更广。第1、2周表达明显增强，到第4周仍有表达。RT—PCR结果也证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。结论阳离子脂质体可以成功介导PEDF—GFP基因转染至BN大鼠的视网膜组织、RPE细胞中，并能够持续表达。视网膜下注射和玻璃体腔注射均为有效的转染途径。本研究为视网膜，脉络膜新生血管性疾病的基因治疗奠定了基础。

色素上皮细胞衍生因子与胶质瘤侵袭的相关性

目的评价色素上皮细胞衍生因子（PEDF）对胶质瘤侵袭的抑制作用。方法将PEDF（100ng／m1）加入胶质瘤细胞U87中（U87PEDF），以未加PEDF蛋白的胶质瘤细胞作对照组（U87com），同时在U87PEDF中加入0．25μg／ml的促血管生成因子（VEGF，U87PEDF＋VEGF）。细胞迁徙实验检测PEDF抑制胶质瘤细胞侵袭性；实时荧光定量逆转录（RT）-PCR检测层粘连蛋白Laminin-8表达。结果迁徙实验结果表明，对照组胶质瘤细胞穿透数明显多于PEDF处理组细胞，加入VEGF后，胶质瘤细胞迁徙率的抑制率仍减少38％；实时荧光定量RT-PCR结果显示，U87对照组Laminin-8α4、β1、γ1mRAN表达分别为（1．043±0．090）、（0．823±0．012）、（0．762±0．005）拷贝／μl，明显高于U87mF组[（0．633±0．004）、（0．442±0．005）、（0．424±0．002）拷贝／μl，P〈0．05]。结论在VEGF存在的条件下，PEDF能有效抑制胶质瘤细胞的迁徙，表明其可能由下调Laminin-8基因的表达所致。

重组人色素上皮衍生因子在真核细胞SP2／0中的瞬时表达及活性鉴定

目的构建抑制早产儿视网膜病新生血管形成的重组人色素上皮衍生因子（pigment epithelium—derived factor，PEDF）真核表达载体，检测其在小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中的瞬时表达。方法根据已知的GenBank中人PEDFcDNA成熟蛋白编码区序列设计特异性引物，以全基因合成的pUC57-PEDF质粒为模板，经聚合酶链反应技术扩增人PEDF基因，定向克隆至真核表达载体pIRESneo3中，获得重组表达质粒pIRESneo3-PEDF。将重组质粒pIRESneo3-PEDF与脂质体转染试剂Lipofectamine^TM 2000混合后转染小鼠骨髓瘤细胞SP2／0，采用酶联免疫吸附试验及Western印迹对表达产物进行鉴定。收集转染细胞培养液上清，采用四甲基偶氮唑盐比色法检测重组PEDF活性。结果聚合酶链反应技术、酶切鉴定和测序结果表明，pIRESneo3PEDF表达载体构建成功。脂质体法将表达质粒成功转染到SP2／0中，经培养，可分泌表达PEDF，且经Western印迹检测证明为人PEDF，分子量为50000。转染36h上清液中PEDF浓度最高，为（0．92±0．04）ug／ml。转染36h细胞培养液上清对人脐静脉内皮细胞的抑制作用最强（P〈0．05）。结论成功构建人PEDF真核表达质粒pIRESneo3PEDF，转染细胞可瞬时分泌表达有活性的人PEDF，对人脐静脉内皮细胞增殖有抑制作用，为开展下一步稳定转染表达及蛋白纯化奠定基础，为早产儿视网膜病的防治带来新的希望。