鱼致病性舒伯特气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为快速准确鉴别检测鳢源致病性舒伯特气单胞菌(A.schubertii),本实验根据该菌的促旋酶B亚单位基因(gyrB)、溶血素基因(hlyA)的保守序列设计引物,建立了检测致病性A.schubertii的双重PCR方法。结果显示gyrB和hlyA基因扩增产物分别为601 bp和375 bp;其最低检出菌体DNA量为2.3×10-2ng,最低检出菌数为3×102cfu。特异性试验结果显示,该方法对温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞菌、柱状黄杆菌、哈氏弧菌以及类志贺邻单胞菌扩增结果均为阴性。应用该方法对37份临床病料样品的检测结果与传统细菌分离鉴定结果的符合率为100%,表明该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于A.schubertii的快速检测和流行病学研究。

舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、灵敏的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)检测方法。【方法】以舒伯特气单胞菌rpoD(RNA polymerase sigma-70 factor)为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立舒伯特气单胞菌的TagMan实时荧光定量PCR检测方法,同时验证该方法的特异性、灵敏度、重复性,并用该方法对50份临床样品进行检测,验证其应用效果。【结果】含舒伯特气单胞菌rpoD基因的质粒拷贝数与循环阈值(Ct)的标准曲线相关系数为1.000,扩增效率为94.705%。实时荧光定量PCR检测方法只对舒伯特气单胞菌的靶基因检测结果呈阳性,对嗜水气单胞菌(Aeromanas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、诺卡氏菌(Nocardia seriolae)等其他14种致病菌的检测结果均为阴性,具有高度特异性;对舒伯特气单胞菌重组质粒和纯培养细菌的检出灵敏度分别为4.76拷贝/μL和15 CFU/mL;批内和批间重复性试验变异系数分别为0.95%和1.05%。50份临床样品检测结果显示,该方法阳性样品检出率为22%,高于传统细菌分离方法(10%)的检出率。【结论】建立的舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于舒伯特气单胞菌的快速诊断检测和流行病学调查。

乌鳢源舒伯特气单胞菌生物学特性及其药物敏感性分析

为了解乌鳢源舒伯特气单胞菌WL-4菌株的生理生化、生长特性、致病因子等生物学特征,以及其对多种药物的敏感性,使用细菌生化鉴定仪检测菌株的生理生化特性,比较不同温度、盐度及p H条件下菌株的生长特征;通过人工回归感染分析菌株的致病性,测定相关的毒力因子并采用PCR方法扩增毒力基因;采用微量二倍稀释法测试菌株对20种抗菌药物的最小抑菌浓度。结果发现,与模式菌株(ATCC43700)相比,两菌株的大部分生理生化特性相同,16S r RNA基因比对,相似度达99.9%;WL-4菌株的最适生长温度为30°C,最适生长盐度为5,最适生长p H为7;29°C时,腹腔注射感染乌鳢苗种的半数致死浓度(LC50)为1.2×106 CFU/m L;该菌株具有溶血性、蛋白酶活性和脂肪酶活性;WL-4菌株对磺胺类及酰胺醇类等8种药物具有耐药性,而对多西环素、新霉素、氨苄西林等12种药物敏感。研究表明,WL-4菌株的生物学特征与其引起的乌鳢内脏类结节病的发生情况相吻合,致病菌的药物敏感性与药物使用情况存在相关性。

舒伯特气单胞菌研究进展

舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)已逐渐成为重要的人、兽、鱼共患致病菌。近年来,舒伯特气单胞菌感染引起的内脏类结节病在养殖鳢科鱼类中较为流行,严重危害鳢养殖业的健康发展,也对畜牧养殖业和人类健康造成潜在的威胁。论文对舒伯特气单胞菌的分类学地位、生物学特性、致病性及检测技术等进行综述,为舒伯特气单胞菌病的有效防控提供参考。

杂交鳢舒伯特气单胞菌弱毒疫苗候选株筛选及其免疫效果评价

为获得一种安全、高效的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)弱毒疫苗候选株,通过鱼体攻毒实验筛选天然弱毒株,用筛选的弱毒株制备弱毒疫苗,对杂交鳢进行免疫后,采用荧光定量RT-PCR方法评价免疫相关基因表达情况,同时采用强毒株攻毒免疫的杂交鳢测定相对免疫保护率(relative percentage survival,RPS),综合评价弱毒株作为活疫苗侯选株的潜力。结果显示:筛选到一株舒伯特气单胞菌天然弱毒株OM170701,其对靶动物杂交鳢与非靶动物大口黑鲈均无明显致病性;该弱毒疫苗候选株能诱导杂交鳢肝脏中IL-8、IL-1β、补体C3表达量上调,免疫后72 h相对表达量达到最高,分别是对照组的相对表达量的4.95倍、5.57倍、3.94倍;免疫组IgM的相对表达量显著高于对照组,其中第28天时免疫组IgM相对表达量是对照组的17.26倍;攻毒后免疫组成活率显著高于对照组,其RPS为65%。结果表明,该弱毒株通过注射免疫能引发杂交鳢非特异性和特异性免疫应答,并提供良好的免疫保护。

60种中草药对舒伯特气单胞菌的体外抑菌作用

【目的】选取60种中草药,研究其对杂交鳢源舒伯特气单胞菌的体外抑菌作用,为防治杂交鳢源舒伯特气单胞菌诱发的疾病提供科学依据。【方法】通过水提法获得60种中草药提取液,采用琼脂扩散法对杂交鳢源舒伯特气单胞菌进行体外抑菌试验,采用二倍稀释法测定筛选出的抑菌作用较好的中草药水提物对杂交鳢源舒伯特气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。【结果】五倍子、大黄、黄柏、黄连、地榆、丁香、木瓜、诃子、五味子、儿茶、乌梅对舒伯特气单胞菌极度敏感,有较好的抑菌效果,其中乌梅的体外抑菌效果最佳,抑菌圈直径为(28.62±0.66)mm。【结论】抑菌杀菌效果最好的是五倍子,其最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均为1.95 mg/mL,其次是诃子、乌梅、地榆、黄连、儿茶和丁香,再次是木瓜和五味子;大黄和黄柏较差。

五种消毒剂对舒伯特气单胞菌杀菌效果研究

为筛选对舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)具有较好杀菌效果的消毒剂及其最小杀菌浓度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC),选用五种消毒剂(聚维酮碘、双链季铵盐碘、大蒜素、二氧化氯、复合碘)进行杀菌实验,设置舒伯特气单胞菌母液浓度为(1~2)×10^3 cfu/mL,五种消毒剂目标浓度均为0.3750mg/L。研究结果表明,双链季铵盐碘对舒伯特气单胞菌杀菌效果最好,杀菌率为63.02%;其次是复合碘,杀菌率为43.56%。当双链季铵盐碘和复合碘两种消毒剂浓度为目标浓度3倍(1.1250mg/L)时,可全部杀灭舒伯特气单胞菌。因此,五种消毒剂对舒伯特气单胞菌都具有一定的杀菌效果,依次为:双链季铵盐碘>复合碘>二氧化氯>大蒜素,其中双链季铵盐碘和复合碘的效果最好,其最小杀菌浓度(MBC)为1.1250 mg/L。

一起由舒伯特气单胞菌引起的食物中毒调查报告

对一起食物中毒的发病经过临床资料、流行病学调查和实验室检查进行综合分析。

鳜源致病性舒伯特气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

【背景】舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)广泛分布于淡、海水水体和底泥中,致病株已在我国养殖鳢科鱼类中流行,也感染其他经济鱼类,导致暴发性死亡。【目的】对病鳜(Siniperca chuatsi)的病原进行鉴定,确定分离菌的致病性及药物敏感性,为该病临床治疗提供参考。【方法】采集病鳜脾肾组织进行PCR或RT-PCR扩增其常见病毒,采集病鳜肝脏和腹水分离培养细菌,PCR扩增代表菌株的gyrB、16S rRNA和毒力基因,鉴定其生理生化特征,并进行药物敏感性试验和人工感染试验。【结果】病鳜的传染性脾肾坏死病毒、鳜蛙病毒、鳜弹状病毒检测结果为阴性,肝脏和腹水均存在大量细菌;代表菌株Gui210820被鉴定为舒伯特气单胞菌,携带溶血素、气溶素、弹性蛋白酶和磷脂酶毒力基因,腹腔注射感染鳜的半数致死浓度(LD50)为3.16×105 CFU/mL;菌株Gui210820对四环素、卡那霉素、复方新诺明等6种抗菌药物耐药,对强力霉素中介,对恩诺沙星、新霉素、氟苯尼考等11种抗菌药物敏感。【结论】本试验从病鳜组织分离到致病性舒伯特气单胞菌,水产准许用药物恩诺沙星、新霉素、氟苯尼考可以用于本次疾病的临床治疗。

四株杂交鳢致病性舒伯特气单胞菌特性及致病性比较

【背景】舒伯特气单胞菌为革兰氏阴性短杆菌,是一种人-畜-鱼共患的条件性致病菌,它能引起不同程度的人类疾病,近年来更是在水产养殖中被频繁报道。【目的】比较分析4株杂交鳢源舒伯特气单胞菌(WL-4、ZL-1、ZL-13、D075)菌株间生理生化特性、致病性以及对常用药物的敏感性差异,为水产舒伯特气单胞菌病的防治提供参考依据。【方法】使用全自动细菌生化鉴定仪检测菌株的生理生化特性;运用PCR扩增和测序比对菌株的gyrB、16S rRNA基因序列;采用改良平板法检测毒力因子表达,PCR技术检测菌株毒力基因和耐药基因的携带情况;通过人工注射感染分析4株舒伯特气单胞菌对杂交鳢的致病性差异;并采用微量二倍稀释法测试15种抗菌药物对菌株的最小抑菌浓度。【结果】以ATCC43700 (人源舒伯特气单胞菌)作为参考,4株菌株理化特性基本相同,gyrB和16SrRNA基因一致性分别为99.57%和100%,聚类分析聚为一簇;不同的舒伯特气单胞菌(ATCC43700、WL-4、ZL-1、ZL-13、D075)均具有溶血性、蛋白酶活性和脂肪酶活性;但人源菌株(ATCC43700)与杂交鳢源舒伯特气单胞菌携带的毒力基因存在差异,其中人源菌株携带了hlyA、ela、lip、ahal、act,而杂交鳢源菌株(WL-4、ZL-1、ZL-13、D075)携带hlyA、ela、lip、ahal、aer;4株杂交鳢源舒伯特气单胞菌对杂交鳢致病性存在差异,1.2×10~5CFU/mL浓度腹腔注射感染健康杂交鳢,WL-4、ZL-1、ZL-13、D075对杂交鳢的感染致死率依次为30%、40%、70%和80%;不同菌株(ATCC43700、WL-4、ZL-1、ZL-13、D075)的药物敏感性以及携带的耐药基因也存在差异。【结论】4株杂交鳢源舒伯特气单胞菌在致病性、药物敏感性等方面存在差异,研究结果有助于进一步开展舒伯特气单胞菌病发病机制和防控技术研究。

黑水虻虫浆对杂交鳢血清免疫、抗氧化指标和肠道形态、菌群及抗病力的影响

本试验旨在研究饲料中添加黑水虻虫浆(BSFLP)对杂交鳢血清免疫、抗氧化指标和肠道形态、菌群及抗病力的影响。添加0(FM,对照)、2%(BSFLP2)、4%(BSFLP4)和6%(BSFLP6)BSFLP湿物质(分别对应添加0、9、18、27 g/kg BSFLP干物质)配制4种等蛋白质和等脂肪的饲料。选取420尾均质量为(10.84±0.01)g的杂交鳢,随机分成4组,每组3个重复,每个重复35尾,养殖周期为56 d。结果表明:各组间血清丙二醛含量、溶菌酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性及总抗氧化能力无显著差异(P>0.05)。与FM组比较,试验组肠绒毛宽度、绒毛高度无显著变化(P>0.05),BSFLP4组肌层厚度、杯状细胞数显著增加(P<0.05)。BSFLP4组肠内容物菌群Shannon指数显著高于FM组(P<0.05),物种多样性增加。BSFLP6组后肠菌群Sobs指数、Chao指数和Ace指数显著高于BSFLP2组(P<0.05)。用舒伯特气单胞菌感染,BSFLP4组死亡率显著低于FM组和BSFLP6组(P<0.05)。综上所述,饲料中添加BSFLP可以改善杂交鳢免疫、抗氧化能力,调节肠道形态和肠道内容物菌群结构、增加菌群多样性进而提高肠道健康,增强抗舒伯特气单胞菌感染的能力。综合来看,杂交鳢饲料中添加18 g/kg BSFLP干物质为宜。

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)内脏类结节病病原菌的分离、鉴定与特性分析

从广东佛山、广州两地养殖场患内脏类结节病杂交鳢(Channa maculata♀×C.argus♂)内脏器官分离到2株细菌,纯化培养后获得2个分离株,编号为WL-1和WL-2,对分离菌株进行了细菌鉴定、致病性分析及药敏实验。应用常规生理生化鉴定和ATB系统细菌自动鉴定仪对分离菌株进行细胞形态学、理化特性分析,初步判定所分离菌为舒伯特气单胞菌。采用16S rRNA基因、DNA促旋酶的B亚单位蛋白(gyrB)基因对分离菌株进行DNA分子鉴定,结果显示,两个菌株间的16S rRNA基因序列相同,gyrB基因序列同源性为99.7%;分离菌株与GenBank上登录的舒伯特气单胞菌16S rRNA基因序列和gyrB基因序列同源性均最高,达99%以上;分离菌株在系统进化树上与舒伯特气单胞菌聚为一族,进一步确认分离株为舒伯特气单胞菌。人工感染健康鱼后出现与自然发病相似的内脏类结节病症状,从发病鱼内脏组织再分离的细菌特性与原感染菌相同。综合理化特性分析、基因鉴定和人工感染实验确认舒伯特气单胞菌是杂交鳢内脏类结节病的致病菌。药敏实验发现分离菌株对头孢唑啉、庆大霉素等14种药物敏感;对青霉素G、苯唑西林2种药物耐受。

基于一个典型案例谈谈对鱼类细菌病诊治的认识与思考

鱼病的病原--病毒、细菌、真菌、寄生虫等的生物学特性差异极大,其对药物的敏感性千差万别,治疗思路与用药方案完全不同。即使是生命力极顽强、以“浮头三天不死”而著称的生鱼(乌鳗、杂交鳗),在每年炎热的夏季也饱受舒伯特气单胞菌病、诺卡氏菌病等细菌性病害的肆虐。尽管“以防为主,防重于治,防治结合”是鱼病防控工作的方针,业内关于鱼病预防的理论、策略、产品(方案)不枚胜举,但是,养殖一线的细菌病依然年年流行,每年都有大量养殖户因之遭受惨重的损失。

杂交鳢TRAF2基因克隆、组织分布及对病原菌感染的应答分析

肿瘤坏死因子受体相关因子2 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 2, TRAF2)是一种重要的胞内信号接头蛋白,参与激活NF-κB和MAPK信号通路,在免疫防御、炎症反应和细胞凋亡等过程发挥关键作用。为了探索杂交鳢(Channa maculate♀×Channa argus♂) TRAF2功能及其对两种病原菌感染的应答机制,本研究克隆获得杂交鳢TRAF2 (命名为CmaTRAF2)基因的完整开放阅读框(ORF),长度为1 566 bp,预测编码521个氨基酸,与龟壳攀鲈(Anabas testudineus)、杜氏鰤(Seriola dumerili) TRAF2蛋白序列相似性最高,都达到91%。与其他TRAF2相似,CmaTRAF2具有一个RING结构域、一个锌指结构域、一个TRAF结构域。系统发育分析表明CmaTRAF2与其他硬骨鱼类TRAF2聚为一支,其中与龟壳攀鲈TRAF2的亲缘性关系最近。实时荧光定量PCR检测分析显示CmaTRAF2在健康杂交鳢所检测的9种组织中广泛分布,其中脾脏中表达量最高,头肾中的表达量次之,肝脏中的表达量最低。采用鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)腹腔注射感染杂交鳢后,肝脏、脾脏和头肾中CmaTRAF2的表达在感染后不同时间点总体呈现为上调趋势,且分别在10 h、1 d和2 d时达到最大值(P<0.05)。舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)注射感染杂交鳢后,CmaTRAF2的表达变化相似,也主要呈现上调趋势,且分别在肝脏、脾脏和头肾中于12 h、5 d和2 d时达到峰值(P<0.05)。以上结果表明,CmaTRAF2参与了杂交鳢抵御鰤诺卡氏菌和舒伯特气单胞菌感染的免疫应答反应。本研究可为进一步探索鱼类TRAF2的免疫防御和信号转导机制提供基础资料。