3种色谱模式联用在中药活性成分初步筛选中的应用

提出了反相高效液相色谱 (RP HPLC)、固定化脂质体色谱 (ILC)以及固定化载体蛋白色谱 (ICPC) 3种色谱模式联用筛选中药中活性成分的新思路 ,并用于传统中药川芎中的生物活性成分的初步筛选。从川芎的甲醇提取液中筛选出几种既有细胞膜的穿透能力又有与载体蛋白的结合能力的成分 ,并对其中两种主要的组分进行了初步的结构鉴定。

基于超大孔聚合物微球的混合色谱模式层析介质的制备

以甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚的超大孔聚合物微球为基质,采用聚乙烯亚胺和丁基缩水甘油醚先后衍生微球的表面,制备成兼具阴离子交换与疏水相互作用的混合色谱模式层析介质。考察离子交换基团、疏水配基密度对蛋白载量、回收率的影响,结果表明,在离子交换容量0.2~0.5 mol/mL范围内,随着介质离子交换容量的增大,蛋白载量及回收率均呈增加趋势,蛋白载量最高值达40 mg/mL,回收率大于90%。当疏水配基的密度大于0.03 mol/mL时,介质开始表现疏水相互作用。此超大孔混合模式色谱介质在大于2000 cm/h的流速下依然能保持低于2 MPa的柱背压,同时在高流速下（2880 cm/h）纯化人血清中的抗体应用中表现良好的分辨率。此介质在高通量分离纯化应用方面具有巨大潜力。

高效液相色谱-二酰胺基色谱柱HILIC模式下对人参口服液中三种人参皂苷的测定

建立高效液相色谱-酰胺基色谱柱HILIC模式,对人参口服液进行含量测定。采用Venusil HILIC为色谱柱(4.5 mm×250 mm),以水和乙腈为流动相进行等度洗脱,建立数学模型,分析整个测定流程。结果表明,人参皂苷Rg_(1)、人参皂苷Re、人参皂苷Rb_(1)在10.0~500μg/mL范围内线性关系良好,相关系数(r^(2))均大于0.9998,系统精密度实验RSD分别为1.01%,1.21%,1.05%,三种人参皂苷的回收率均较好。研究为人参口服液中人参皂苷Rg_(1)、人参皂苷Re、人参皂苷Rb_(1)的检测提供参考和借鉴。

“一锅法”制备聚(苯乙烯-丙烯酸)共聚物改性的硅基固定相及其在混合模式液相色谱中的应用

聚合物作为一种来源广泛、功能基团丰富、生物相容性良好的修饰配体,被广泛用作硅基色谱固定相。本工作以苯乙烯和丙烯酸为聚合单体,乙烯基三甲氧基硅烷为硅烷偶联剂,通过自由基聚合反应一锅法制备了聚(苯乙烯-丙烯酸)共聚物改性的硅基固定相(SiO_(2)@P(St-b-AA))。傅里叶红外光谱、热重分析、扫描电镜、N_(2)吸附-脱附、Zeta电势分析等表征手段证明了该固定相已成功合成,且保持了良好的介孔球形结构。在固定相性能评价中,分别采用疏水性分析物、极性分析物和离子型化合物作为探针,对固定相的分离性能和保留机理进行了考察。其中,由于苯环提供的疏水和π-π相互作用,烷基苯和多环芳香烃在固定相上的保留随着流动相中甲醇含量的增加而减弱;由于羧酸基团可以为固定相与核苷碱基等极性溶质之间提供亲水相互作用,随着流动相中乙腈含量的增加,极性分析物的保留逐渐增强;与自制的C18和Amide固定相相比,SiO_(2)@P(St-b-AA)固定相在反相和亲水模式下均表现出良好的分离性能。此外,通过探究流动相pH对离子型化合物保留的影响,证明了该固定相还具有弱阳离子交换能力。多种分离模式表明SiO_(2)@P(St-b-AA)固定相可提供多种相互作用,并在不同极性组分分析物的分离中具有良好的应用前景。通过考察制备方法的重复性,证明了该方法具有良好的制备批次稳定性,简便的“一锅法”为新型聚合物改性硅基固定相的发展提供了一种新思路。

色谱技术在抗体分离纯化中的应用进展

抗体作为一类重要的生物药物,在疾病诊断和治疗等方面拥有广阔的前景。抗体药物的需求逐年上升,生产规模不断扩大,下游抗体纯化已经成为抗体药物生产的瓶颈。色谱技术具有选择性好、分离效率高等优点,在抗体纯化领域占据主导地位。抗体分离纯化流程一般包括样品的粗提、粗提物精制和抗体精纯3个步骤,每个步骤都涉及色谱分离技术。目前已有多种色谱技术(如亲和色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、混合模式色谱以及新型的温敏色谱等)应用于抗体的分离纯化。本文介绍了近年来国内外各种色谱技术在抗体分离纯化方面所取得的研究进展,并对抗体色谱分离技术的未来发展趋势进行了展望。

基于混合模式色谱生物活性肽的分离研究进展

生物活性肽是一类具有生理活性的小分子蛋白类物质,对其进行高效分离纯化有助于进一步发挥其生物活性和研究其构效关系。然而目前活性肽分离步骤繁琐。鉴于此,研究者开发了混合模式色谱(mixed-mode chromatography,MMC)分离技术:同时利用活性肽在亲疏水、电荷特性等方面的性质差异,通过对固定相进行多重改性,并辅以不同流动相,在分离过程中MMC可发挥多重保留机制,从而实现对特定肽段的高效分离。MMC具有固定相可控、可特异性识别和分离效率高等优点。本文梳理和总结MMC固定相以及对生物活性肽的分离研究及应用现状,以期对活性肽的高效利用提供参考。

混合模式色谱分离材料的研究及其应用进展

近年来混合模式色谱以其独特的分离特性受到人们越来越多的关注。混合模式色谱的种类主要集中在反相/离子交换混合模式色谱(reversed-phase/ion-exchange mixed-mode chromatography,RPLC/IEX),亲水作用/离子交换混合模式色谱(hydrophilic interaction/ion-exchange mixed-mode chromatography,HILIC/IEX),反相/亲水作用混合模式色谱(reversed-phase/hydrophilic interaction mixed-mode chromatography,RPLC/HILIC)等混合模式。两种或多种机理混合使用,往往在分离选择性和色谱峰形等方面能得到不同于单一模式操作所得到的效果,分离选择性以及色谱峰形等都能得到极大的改善与提高,这使得混合模式色谱渐渐进入研究者们的视野。混合模式色谱的研究多数集中在色谱填料的设计。混合模式色谱填料的应用主要针对生物样品的分离分析。该文综述了近年来混合模式色谱的研究及其应用进展,并展望了混合模式色谱的发展。

一种混合模式反相强阳离子交换色谱固定相的制备及其保留机理的考察

采用一种简单的"混合配体"方法将辛基和磺酸基键合到硅胶表面,制备了辛基-磺酸基共同键合硅胶(OSS)材料。通过元素分析和吸附容量检测对OSS材料进行表征,证明辛基和磺酸基已成功键合到硅胶表面上。将该OSS硅胶材料作为混合模式反相强阳离子交换(RP/SCX)色谱固定相,在反相液相色谱(RPLC)流动相条件下,采用几种碱性探针分子定量地考察了该固定相的混合模式RP/SCX保留机理。通过改变流动相中缓冲盐的浓度,考察了溶质保留因子和盐浓度的对数和倒数的关系,得到了几种碱性探针分子在该混合模式OSS固定相上的单点和两点保留机理的数学模型。对两种数学模型的方程进行了线性拟合,结果表明两点保留机理更加符合实验的结果。此外,根据混合模式两点保留机理的数学方程,可以得到单一的疏水或离子交换作用力对总保留的影响,对混合模式色谱的实际分离应用可提供有价值的参考。

一种混合模式反相弱阳离子交换色谱填料的制备及其保留机理

采用"点击化学"的合成方法制备了一种混合配体的辛基-羧基共同键合硅胶(OCS)材料,经元素分析和红外光谱表征,证明了辛基和羧基官能团均已成功键合到硅胶表面。将其作为混合模式反相弱阳离子交换(RP/W C X)的固定相填料,以3种同系物阳离子表面活性剂作为探针分子,定量研究了该固定相的混合模式保留机理,考察了溶质保留因子与盐浓度和溶质亚甲基数目的关系,验证了混合模式固定相的单点和两点保留机理的数学模型,并进一步将其应用于一系列标准碱性混合物的分离。结果表明:两点保留机理更加符合实验的结果;根据混合模式两点保留机理的数学方程,可以得到单一的疏水或离子交换作用力对总保留的影响,对混合模式色谱的实际分离应用提供了有价值的参考。本文建立了反相弱阳离子交换混合模式OCS固定相的保留机理的定量模型,并证明了该固定相在碱性化合物的分离中具有很大的应用前景。

混合模式色谱固定相的研究和应用进展

混合模式色谱在分离分析过程中具有比单一模式色谱更复杂的保留机理和更高的分离选择性,且便于多维液相色谱的构建。根据色谱固定相的不同化学特性,主流的混合模式色谱以反相/亲水作用色谱、亲水/离子交换作用色谱、反相/离子交换作用色谱3种混合模式为主。重点介绍了近年来混合模式色谱固定相的研究及应用进展,并对混合模式色谱及固定相的发展前景进行了展望。

咪唑侧基功能化聚离子液体修饰的混合模式色谱固定相的制备及其色谱性能

该文合成了咪唑侧基功能化的离子液体单体1-(4-乙烯基苄基)-3-氰甲基溴化咪唑盐,通过表面引发原子转移自由基聚合将该单体接枝到硅胶表面,制备了一种新型混合模式色谱固定相。采用红外光谱、元素分析及热重分析对其结构进行表征。该色谱固定相具有良好的分离能力。通过研究流动相pH对物质保留的影响,验证了物质在该固定相上存在反相-离子交换保留机理。通过与十八烷基硅烷键合硅胶固定相比较,证实了该聚离子液体固定相对物质保留提供了π-π作用。结果表明,对咪唑侧基功能化是制备新型离子液体固定相的可行方法。

使用新型混合模式色谱柱HPLC法测定赖诺普利原料药中的三氟乙酸

目的:使用新型混合模式色谱柱高效液相色谱法测定赖诺普利原料药中的三氟乙酸。方法使用新型混合模式色谱柱(Thermo Acclaim Mixed-Mode WAX-1,250 mm×4.6 mm×5μm);以0.15 mol/L磷酸二氢钠溶液(用6 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0)-甲醇-乙腈体积比80∶10∶10为流动相;柱温为30℃;流速为1.0 mL/min;检测波长为210 nm;进样量为50μL。结果:三氟乙酸在2.4985~99.9400μg/mL范围内线性关系良好(r=0.9999);检测限为0.7496μg/mL,定量限为2.4985μg/mL;加标回收率平均值为101.1%(RSD=0.59%,n=9)。结论:该方法准确、快速、方便,适用于赖诺普利原料药中三氟乙酸的测定。

双阳离子型离子液体和十八烷基修饰的混合模式硅胶固定相的制备及色谱性能

通过分步键合反应制备了一种咪唑基双阳离子型离子液体和十八烷基共同修饰的混合模式硅胶色谱固定相(Sil-C18-IL-C4);采用元素分析和红外光谱对其进行了表征.分别评价了该固定相在反相色谱模式(RPLC)、亲水色谱模式(HILIC)和RPLC/HILIC混合色谱模式下的色谱分离性能,并在HILIC模式下对6种碱基核苷类化合物进行分离,考察了流动相中有机相体积分数和水相中甲酸铵浓度对分离效果的影响.此外,还考察了该固定相的分离重复性.制备的Sil-C18-IL-C4固定相的元素分析结果表明,氮元素含量为1.65%,碳元素含量为11.16%,氢元素含量为2.44%.该固定相的红外光谱中,2928和2856 cm^(‒1)处出现了—CH的不对称和对称伸缩振动峰,1440和660 cm^(‒1)处出现了咪唑环上C=C的伸缩振动峰和C=N的弯曲振动峰,说明十八烷基和1,5-双(咪唑-1-基)戊烷均已接枝到硅胶表面.色谱性能评价结果表明,Sil-C18-IL-C4固定相可表现出反相色谱模式和亲水色谱模式分离性能,对6种碱基核苷类物质能够实现完全分离,而且在一定的色谱条件下可以在单根色谱柱单次运行中实现RPLC/HILIC混合模式色谱分离,对于处理复杂样品中的碱基核苷类化合物等亲水物质具有良好的应用潜能.

混合模式色谱相测定四神丸中的吲哚类生物碱与木脂素类化合物

目的:建立混合模式固定相的高效液相色谱法测定四神丸中的吲哚类生物碱与木脂素类化合物。方法:Hypersil Duet C_(18)/SAX (250 mm×4. 6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0. 5%磷酸为流动相,梯度洗脱,流速为1. 0 ml·min^(-1),检测波长为240 nm,柱温为35℃,进样量10μl。结果:吴茱萸碱、吴茱萸次碱、补骨脂素、五味子乙素与异补骨脂素在混合模式色谱中完全分离;线性关系良好;线性范围分别为0. 110～2. 120μg·ml^(-1)(r=0. 999 9),0. 119～2. 387μg·min^(-1)(r=0. 999 8),0. 121～2. 417μg·min^(-1)(r=0. 999 4),0. 119～2. 387μg·ml^(-1)(r=0. 999 2),0. 104～2. 084μg·ml^(-1)(r=0. 998 7),加样回收率分别为97. 1%(RSD=0. 9%),101. 7%(RSD=1. 5%),96. 8%(RSD=1. 1%),94. 9%(RSD=0. 4%),98. 6%(RSD=1. 2%)(n=6)。结论:该方法准确性、耐用性良好,可用于四神丸质量控制。

混合模式色谱介质的制备及其在蛋白分离纯化中的应用

随着生物制药技术的迅速发展,生物制品的制备规模和质量要求的提高对下游分离纯化工艺提出了新的要求。如何通过分离纯化手段快速获得目标产物并进一步降低成本是现代生物分离技术研究的热点问题。混合模式色谱技术是一种高效的分离纯化方法,一般兼有多种作用模式,并且其蛋白结合量高、选择性好、洗脱条件温和、具有耐盐吸附等多种特性,可减少对料液的预处理操作,从而提高分离效率,降低生产成本。因此,该技术被广泛应用于蛋白质的分离纯化及相关领域中。本文对混合模式色谱技术的发展历程、分离机理、基质、配基类型及其在蛋白分离纯化中的应用等方面进行阐述,对当前混合模式介质的制备及其应用中存在的问题进行概括,希望能够为该项技术在生物制品制备生产中的应用提供一些参考。

混合模式色谱-串联质谱联用快速和高灵敏检测植物组织内源性细胞分裂素

基于混合模式色谱-串联质谱联用技术,建立了一种简单、快速、灵敏的植物组织中内源性细胞分裂素（CKs）的分析检测新方法。采用大体积进样技术,提高了方法灵敏度。同时,由于混合模式色谱对CKs具有良好的分离能力,简化了前处理步骤。植物提取液经过C18固相萃取（SPE）小柱进行除杂,收集流出液并用氮气吹干后,复溶于700μL水中,进样540μL于高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）进行分析检测。该方法在1∽500pg/mL范围内线性关系良好,线性相关系数（r）大于0.9956;7种细胞分裂素的检出限（以3倍信噪比计算）在0.05∽0.23pg/mL之间;日内、日间相对标准偏差小于15.7%。所建立的方法已成功运用于不同植物组织和番茄幼苗中不同组织部位的内源性CKs种类及含量的分析。

混合模式色谱柱离子色谱法同时测定奶粉中的碘离子和硫氰酸根

碘离子和硫氰酸根的含量是奶粉质量检测的重要项目,但由于奶粉基体复杂,色谱分析中容易产生干扰。本文使用一种带有疏水性烷基链和弱阴离子交换官能团的混合分离模式色谱柱Acclaim Mixed-Mode WAX-1,成功实现了碘离子、硫氰酸根与样品中干扰峰的基线分离,并用紫外检测器进行了检测。实验中将奶粉样品溶于水后,用乙腈沉淀蛋白,并通过OnGuardRP前处理柱除去对色谱柱有污染的有机物质。所用淋洗液为乙腈-100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6)-水(体积比为45:5:50),紫外检测波长为226nm。该方法对碘离子和硫氰酸根的检出限分别为4.6μg/L和13.8μg/L,0.2mg/L标准溶液峰面积的相对标准偏差分别为1.2%(n=6)和1.7%(n=6)。该分析方法准确可靠,线性范围宽,检出限较低,为乳制品质量检测提供了可行方法。

反相/亲水/阳离子交换混合模式色谱固定相的制备及在药物分离中的应用

通过巯基-烯点击化学方法,合成了一种新型双配体苯磺酸混合模式固定相(Ph/BS),通过元素分析和13C固体核磁共振进行表征。根据溶质结构和流动相组成不同,该混合模式固定相可提供反相(RP)、亲水(HILIC)和强阳离子交换(SCX)多种作用模式。反相条件下分离苯同系物,体现了较好的亚甲基选择性。使用小分子核苷和碱基对亲水色谱行为进行了评价;溶质的保留因子随流动相中水相含量的变化呈现典型的U型曲线,说明Ph/BS固定相具有RP/HILIC双重保留机理。胺类化合物在该固定相上的保留体现了RP/SCX混合色谱的特征。另外,应用Ph/BS固定相在SCX模式下高效分离了二甲双胍及其杂质,在RP/SCX模式下同时分离了酸性、中性和碱性药物。结果显示,该混合模式固定相在复杂样品的分离分析方面具有潜在的优势。

C18-磺酸基双改性液相色谱固定相的制备与评价

以十八烷基三氯硅烷和3-巯丙基三甲氧基硅烷为改性剂,采用一锅法对硅胶表面加以修饰,进一步将巯基氧化制备成C18-磺酸基双改性液相色谱固定相。在优化的反应条件下得到了十八烷基和磺酸基摩尔比为3∶7的固定相,分别采用扫描电镜、元素分析、红外光谱对固定相的形貌和特征加以表征。针对制备的固定相,在不同的分离模式下,系统考察其色谱分离性能。在反相色谱模式下,成功分离了5种烷基苯化合物;在亲水模式下,分离了3种核苷;进一步应用于牛血清白蛋白酶解产物的分离,得到了较好的结果。实验结果表明,制备的混合模式固定相同时具有多种分离机理,在分离复杂样品、调整选择性方面具有潜在的优势。

氨基己酸为配基的新型弱阳离子交换/疏水双功能色谱固定相对蛋白质的分离纯化

以硅胶为基质、氨基己酸为配基制备了一种新型弱阳离子交换/疏水(WCX/HIC)双功能混合模式色谱固定相。该固定相配基具有一定的疏水性且含有羧基,在高盐浓度下表现为HIC的性质,可作为HIC固定相使用;在低盐浓度条件下表现为离子交换的性质,可作为WCX固定相使用。分别考察了该介质在WCX和HIC两种模式下对标准蛋白质的分离性能,并与商品柱进行比较。结果表明,所合成的WCX/HIC双功能固定相在WCX和HIC两种模式下对蛋白质均有较高的分离度和选择性,且分离能力与商品柱相当,两种模式下标准蛋白质的质量和活性回收率均大于93%,表明该柱具有"一柱二用"的功能,适于生物大分子的分离纯化。基于此双功能色谱柱构建的在线单柱二维液相色谱(2DLC-1C)可在60 min内实现8种蛋白质的快速分离。在70 min内完成了对蛋清中溶菌酶的二维纯化,纯度可达到98.3%。该技术中一根色谱柱可当作两根色谱柱使用,对蛋白质组学研究和重组蛋白药物的生产具有重要的应用价值。