孕妇外周血浆中艾杜糖-2-硫酸酯酶活性测定在黏多糖贮积症Ⅱ型无创产前诊断中的应用评价

目的探讨黏多糖贮积症Ⅱ型非损伤性产前诊断途径。方法测定36例孕妇孕前、孕早期和孕中期外周血浆中艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)活性变化趋势,同时,测定胎儿绒毛组织或经培养羊水细胞中IDS酶活性,并提取胎儿DNA,进行胎儿性别鉴定和IDS基因分析。结果有创产前诊断检出19例正常胎儿(7例男性不受累胎儿、12例女性非携带者胎儿)、7例男性受累胎儿、9例女性携带者胎儿和1例双胎(一男一女,不受累);正常胎儿孕母在孕前、孕早、中期血浆中IDS的活性分别为283.4±81.6、470.5±89.4、507.9±81.0nmol/4h·ml(男性不受累胎儿)和306.0±85.5、455.8±129.4、513.3±157.6nmol/4h·ml(女性非携带者胎儿),均显著高于男性受累胎儿和女性携带者胎儿孕母同期血浆IDS活性(分别为160.5±47.5、145.8±36.8、144.9±45.8nmol/4h·ml和214.9±74.8、327.6±133.4、375.3±120.4nmol/4h·ml)(P<0.05);正常胎儿和女性携带者胎儿孕母血浆IDS活性随着孕周的增加持续升高(P<0.05),但女性携带者胎儿组升高的幅度较正常胎儿组小;当为男性受累胎儿时,孕妇血浆IDS活性早期即显示低于孕前,且随着孕周的增加,酶活性持续降低。结论孕妇外周血中IDS活性测定可用于黏多糖贮积症Ⅱ型的非损伤性产前诊断。

粘多糖贮积症Ⅱ型患者艾杜糖-2-硫酸酯酶基因常见突变的检测

目的 探讨并建立粘多糖贮积症 型 (mucopolysaccharidosis ,MPS )患者艾杜糖 - 2 -硫酸酯酶 (iduronate- 2 - sulphatase,IDS)基因常见突变的检测方法。方法 应用聚合酶链反应 -单链构象多态性(polymerase chain reaction- single strand conformation polymorphism,PCR- SSCP)对 IDS基因突变热点外显子 3、8和 9进行点突变检测 ;应用 DNA测序对 PCR- SSCP检出的突变进行序列分析 ;应用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 (polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism,PCR-RFL P)对 DNA测序的结果进行检测。结果 经 PCR- SSCP发现该患者的 IDS基因外显子 9有明显异常泳动的条带 ;DNA测序发现患儿的外显子 9发生点突变 (C16 72 T) ,从而导致患者艾杜糖 - 2 -硫酸酯酶蛋白发生氨基酸替换 (R46 8W) ;PCR- RFL P电泳检测结果显示粘多糖贮积症 型患者仅出现 5 5 4bp 1条带 ,而患儿父母出现 2 5 7bp和 2 97bp 2条带 ,进一步验证了序列分析的结果。结论 PCR- SSCP分析、DNA序列分析和 PCR- RFL P分析是诊断 MPS 的有效方法 ,三者联合使用可以相互验证、互为补充 ,提高基因诊断的准确率和成功率。

艾杜糖-2-硫酸酯酶活性测定在黏多糖贮积病Ⅱ型产前诊断中的应用

目的评估黏多糖贮积病Ⅱ型(MPSⅡ)高危孕妇胎儿绒毛和孕妇外周血血浆艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)活性以及基因分析在MPSⅡ产前诊断中的应用。方法回顾性分析2013年2月至2020年12月在广州市妇女儿童医疗中心进行产前诊断的23例MPSⅡ高危孕妇的酶学检测及基因分析结果,采用人工底物荧光法检测胎儿绒毛(30例)和血浆(28例)IDS酶活性,以非高危妊娠孕妇的28例绒毛和34例血浆检测值为对照,绒毛同时送检基因检测和胎儿性别鉴定。组间比较采用独立样本t检验。结果非MPSⅡ高危孕妇胎儿绒毛和血浆IDS活性正常参考值为绒毛(71.2±23.4)nmol/(mg·4 h),血浆(611.1±114.5)nmol/(mL·4 h);30例高危胎儿绒毛中8例男性受累胎儿绒毛IDS酶活性为(1.7±0.3)nmol/(mg·4 h),显著低于11例男性非受累胎儿[(83.2±6.3)nmol/(mg·4 h)]和9例女性非携带者胎儿[(80.0±7.5)nmol/(mg·4 h)](t=10.8、8.8,均P<0.01)。28份MPSⅡ高危孕妇外周血血浆IDS酶活性中8例受累男性胎儿孕母外周血IDS酶活性(225.4±20.5)nmol/(mL·4 h),显著低于男性胎儿非受累孕母IDS酶活性[(451.0±15.1)nmol/(mL·4 h)]和女性非携带者胎儿孕母IDS酶活性[(467.7±45.3)nmol/(mL·4 h)]。30例MPSⅡ高危胎儿绒毛中找到已知致病性突变8例,突变位点分别为c.1048A>C、c.212G>A、c.514C>T、c.257C>T、c.425C>T、c.998C>T,其中6例IDS酶活性显著降低,均为男性受累胎儿,另2例IDS酶活性正常,为女性携带者胎儿。结论孕妇外周血血浆与绒毛IDS酶活性及基因结果有很好的相符性,对孕早期产前诊断MPSⅡ有重要参考价值;当先证者未找到基因突变或新突变的致病性尚不清楚时可单独检测绒毛酶活性进行产前诊断MPSⅡ。

艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶与结直肠癌转移及预后的关系

目的寻找与结直肠癌转移相关并具有预后预测意义的溶酶体分子。方法获取TCGA数据库结直肠癌数据集(Colon Adenocarcinoma TCGA-632)结直肠癌临床样本信息和基因转录组测序表达矩阵;通过基于LASSO(least absolute shrinkage and selection operator)算法的Logistic回归筛选与远处转移相关的溶酶体基因;进一步利用基于LASSO算法的COX回归模型,筛选与结直肠癌患者预后相关的基因,并选择回归系数最大的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronic acid-2-sulfatase,IDS)进行研究;收集本院2007-2008年50例结直肠癌患者肿瘤组织标本进行免疫组织化学染色,分析组织中IDS表达量与转移及预后的关系。结果 TCGA数据库分析显示:发生淋巴结转移的结直肠癌患者IDS mRNA相对表达量高于无淋巴结转移的患者(N0vsN1-2:-0.103±0.073 vs 0.303±0.123,P=0.003);发生远处转移的结直肠癌患者IDS mRNA相对表达量高于无远处转移的患者(M0vsM1:0.017±0.071 vs 0.636±0.296,P=0.003);IDS高表达患者的预后较低表达患者不良(总体生存期:P=0.008;无病生存期:P=0.007);COX回归分析显示:IDS mRNA高表达是结直肠癌患者预后不良的独立预测因素(P=0.014,风险系数为2.651,95%CI:1.217~5.775);50例结直肠癌组织免疫组化分析显示:发生淋巴结转移的结直肠癌患者IDS mRNA相对表达量高于无淋巴结转移的患者(N0vs N1-3:27.324±0.698 vs 40.674±3.528,P=3.0×10^-5);发生远处转移的结直肠癌患者IDS mRNA相对表达量高于无远处转移的患者(M0vs M1:27.941±0.952 vs 39.320±3.467,P=1.2×10^-5);IDS高表达患者预后不良(P=7.2×10^-5);COX回归分析显示:IDS高表达是预后不良的独立预测因素(P=0.008,风险系数为5.847,95%CI:1.585~21.568)。结论 IDS高表达的结直肠癌患者转移发生率高、预后差,IDS可作为结直肠癌患者独立预后预测因子。

硫酸酯酶2型基因体内表达促进5-氟脲嘧啶诱发的小鼠骨髓抑制恢复作用研究

采用半定量RT-PCR和重组基因体内表达法观察了硫酸酯酶2基因(Sulfatase 2,Sulf2)在5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)诱发的小鼠骨髓抑制和再生过程中作用。结果表明:Sulf2在小鼠骨髓抑制和再生过程中呈现先上升,后下降的动态表达;电转pcDNA3.1-Sulf2基因实验组外周血白细胞数和血小板数在5-Fu注射后第7天分别为(1216.7±457.9)/μl和(8.1±5.4)万/μl,明显低于对照组[分别为(1691.7±228.9)/μl和(14.7±2.1)万/μl],实验组单条腿骨髓细胞总数在第7天为(94.2±21.1)万,显著低于对照组(173±59.9)万,但在第11天为(585±337.9)万,又显著地高于对照组(255±65.3)万,实验组第7天10000个骨髓细胞总集落形成数为(9±8.4),显著低于对照组(39±12.2),统计均有显著性差异(p<0.05)。这些结果提示Sulf2可能对5-Fu诱发的小鼠骨髓抑制后的再生具有促进作用。

粘多糖贮积症Ⅱ型患者IDS基因的2个新突变

为了研究粘多糖贮积症Ⅱ型（MPSⅡ）患者发病的分子遗传学机制，采用PCR扩增艾杜糖-2-硫酸酯酶（IDS）基因突变热点区（外显子2、3、5、7、8和9）、DNA测序分析和限制性内切酶图谱分析的方法，对2个粘多糖贮积症Ⅱ型家系进行了遗传突变分析。结果表明，2个家系患者的IDS基因分别出现IVS6-1g→a和c．1587～1588 ins T2个新突变。前者属于单碱基替换，位于内含子6的3’端剪接位点，导致跨外显子剪接；后者属于插入突变，插入点位于外显子9的cDNA1，587和1，588碱基之间，是迄今为止报道的人类IDS基因插入突变中最接近肽链末端的突变，导致移码突变和转录提前终止。经限制性酶切分析，证实2个家系中的患者母亲是突变基因的携带者，符合该病X染色体隐性遗传的规律。另外，在对随机抽取的50名正常人及另外6名不相关的粘多糖病人的测序分析中，未检测到这2个突变，说明不是多态性。对于筛查所得的2个新突变是否是患者的致病原因，尚需进一步证实。

中国南方三个Hunter综合征家系的病因学研究

【目的】揭示中国南方3个Hunter综合征家系的分子发病机制,阐明患者表型和基因型的相关性,为今后的产前或植入前基因诊断奠定基础。【方法】在临床初诊和系谱分析的基础上,首先进行尿糖胺聚糖定性检测,然后抽取患儿及其亲属的抗凝血,提取DNA并通过PCR、Sanger测序对IDS基因进行序列分析。对发现的新变异采用RT-PCR和生物信息分析等多种方法进行致病性鉴定。【结果】3个家系的患者尿检结果均为强阳性(++)。家系1~3先证者为男性,IDS基因均发生半合子突变且突变均来自其母,突变位点分别为:c.615_622delCATACAGT,c.847_848delGT和IVS7 ds+1 G>A。跨物种保守性分析结果显示IDS基因突变部位所在的氨基酸在物种进化过程中具有高度保守性。与正常蛋白相比,突变蛋白的高级结构预测结果存在明显差异。根据ACMG标准,3个家系的变异均为致病性突变。【结论】先证者所患疾病为Hunter综合征,IDS基因的c.615_622del(p.Ile206Valfs*18)、c.847_848del(p.Val283Alafs*57)和IVS7 ds+1 G>A(p.G336Dfs*12)均是新的致病性突变,它们是引起患儿发病的内在原因。本研究进一步丰富了IDS基因的突变谱。

中国广东Hunter综合征患者的T1140C新突变

应用尿黏多糖含量检测、干血滤纸片直接扩增、PCR产物直接测序法对患者及其父母等的IDS基因的突变热点exons 9,3,8进行突变检测。发现患儿IDS基因的exon 8发生一新的错义突变,突变部位在第339位密码子(CTA)内,即cDNA第1 140 bp的T突变为C,导致原339位的“亮氨酸CTA”突变为“脯氨酸CCA”。该患儿为这一突变的半合子,而其母为这一突变的杂合子。该错义突变改变了IDS酶的一级结构和三级空间结构,从而可能引起IDS酶活性大大降低,这可能是该Hunter综合征患者的真正致病原因。

中国黏多糖贮积症Ⅱ型家系的1467-A新突变

黏多糖贮积症Ⅱ型(MPSⅡ)具有高度遗传异质性.应用PCR-DNA测序等方法对中国MPSⅡ家系的IDS基因的突变热点进行研究,发现1467-A新突变.该突变位于exon9编码区内第448位的密码子,即cDNA第1467bp的腺嘌呤(A)后缺了1个A.这一移码突变使得新序列在第460位提前遇上终止密码TGA,导致氨基酸从正常的550个减至459个,这一变异引起IDS酶蛋白一级结构和三级立体结构发生显著改变,导致IDS酶活性严重降低.推测此突变可能是引起本病的直接原因,为产前基因诊断创造了必要的前提条件.

高效液相色谱-外标法定量芥蓝中芥子油苷

研究了利用2-丙烯基芥子油苷外标法定量芥蓝中芥子油苷的可行性,并对芥蓝中芥子油苷种类及含量进行报道。结果表明,2-丙烯基芥子油苷在14.2U硫酸酯酶的脱硫下,经过高效液相色谱检测,峰面积与浓度呈正比,建立回归方程:y=3E-07x+0.001,相关系数达到0.9994。回收及对比实验表明,2-丙烯基芥子油苷外标法定量的结果准确可信,可以代替昂贵的内标苯甲基芥子油苷。经HPLC/ESI-MS鉴定和外标法定量,在芥蓝菜薹中存在11种芥子油苷,其中脂肪族7种,吲哚族4种。脂肪族和吲哚族芥子油苷分别占总量的63.41%和36.59%。含量最高的为3-丁烯基芥子油苷,最低的为4-甲硫基丁基芥子油苷。

IDS基因同义突变致黏多糖贮积症Ⅱ型一家系报告

目的探讨黏多糖贮积症Ⅱ型(MPSⅡ)的临床表现及基因变异。方法分析1例MPSⅡ先证者及其家系成员的临床资料、基因检测及艾杜糖-2-硫酸酯酶活性检测结果。结果先证者,男,15岁,体格发育障碍、听力下降。影像学示脑室系统扩大,椎骨、肋骨等骨发育不良。尿黏多糖阳性。IDS的8号外显子同义突变(c.1122C>T)。先证者及其母亲的艾杜糖-2-硫酸酯酶活性分别为0、6.96 nmol/(4 h·mg)。诊断为MPSⅡ。家系中有6例患者及1例疑似者,全为男性,除先证者外,还有1例存活,其余4例夭折。1例疑似者于孕7月余时产前诊断脑积水终止妊娠。检测到5例女性携带者。结论先证者经艾杜糖-2-硫酸酯酶活性检测和基因检测确诊为MPSⅡ,发现多名女性致病基因携带者及男性患者。

黏多糖贮积症Ⅱ型的诊断及治疗进展

黏多糖贮积症Ⅱ型(MPSⅡ)是一种溶酶体贮积症,为X连锁的单基因遗传病,其是由于体内缺乏艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase,IDS),从而导致糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)在溶酶体中的积累。随着GAG在组织细胞内的逐渐沉积,导致各个脏器功能受损。儿童患者发病年龄不同,症状复杂,早诊早治才能更好地控制病情。本文主要介绍MPSⅡ近年来的诊断及治疗进展,为临床医生提供更好的借鉴。

一个黏多糖贮积症Ⅱ型家系的IDS基因致病变异特征分析

目的鉴定1个黏多糖贮积症Ⅱ型(mucopolysaccharidosis typeⅡ,MPSⅡ)家系的遗传变异,并对变异位点艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS):c.323A>C进行功能学研究。方法收集中国北方地区1个五代83名个体的MPSⅡ家系,其中包括4例患者。通过尿液黏多糖、Alder-Reilly小体检测对该病进行辅助诊断,并对核心家系成员进行IDS酶活性检测;通过对MPSⅡ家系患者进行全外显子组测序及生物信息学分析,筛选出该家系候选变异位点,并通过PCR-Sanger测序进一步确定变异位点。最后,针对致病基因变异位点,将野生型IDS过表达质粒(pCMV-hIDS-WT)及携带突变位点的IDS过表达质粒(pCMV-hIDS-c.323A>C)分别转染COS-7细胞,进行IDS酶活性检测。结果先证者(Ⅳ3)及Ⅳ4经尿液黏多糖、Alder-Reilly小体及IDS酶活性检测诊断为MPSⅡ,Ⅳ3、Ⅳ4、Ⅲ19和Ⅲ32基因检测均携带IDS:c.323A>C错义变异,确诊为MPSⅡ患者;并有8名个体为IDS:c.323A>C错义变异携带者,Ⅱ2、Ⅱ4、Ⅱ8、Ⅱ12、Ⅱ14、Ⅲ5、Ⅲ7、Ⅳ14排除MPSⅡ诊断。COS-7细胞体外实验结果显示,该错义变异可导致IDS酶活性显著降低。结论本研究确定了IDS:c.323A>C:p.Y108S在体内和体外均可导致IDS酶活性显著降低,判定为MPSⅡ的致病性变异。

粘多糖贮积症Ⅱ型患者IDS基因的一个新突变

目的 研究粘多糖贮积症 型 ( mucopolysaccharidosis type ,MPS )患者的艾杜糖 - 2 -硫酸酯酶 ( iduronate- 2 - sulfatase,IDS)基因的基因突变。方法 应用聚合酶链反应 -单链构象多态性( polymerase chain reaction- single strand conformation polymorphism,PCR- SSCP)对患者的 IDS基因可能的常见突变第 2、3、5、7～ 9外显子进行检测 ,并对 PCR- SSCP检出的突变进行直接测序 ,测序发现的突变进行 PCR-限制性酶切分析验证。结果 经 PCR- SSCP和 DNA序列分析发现该患者的第 7外显子发生新的点突变 ( G12 5 3T) ;聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 ( PCR- RFL P)电泳检测示患者和母亲出现突变导致的酶切位点 ,进一步验证了序列分析结果。结论 筛查所得的点突变 G12 5 3T可能是该 MPS

Hunter综合征患者IDS基因的一个新突变

目的研究Hunter综合征患者的艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase,IDS)基因的突变情况,为产前基因诊断等打下基础。方法应用尿粘多糖含量检测、聚合酶链反应-变性高效液相色谱(poly-merase chain reaction-denaturing high-performance liquid chromatography,PCR-DHPLC)分析对1例Hunter综合征患者及其父母的IDS基因的突变热点第9、3、8外显子进行突变检测,并对PCR-DHPLC检出的突变样品进行直接测序。结果经PCR-DHPLC分析发现该患者的IDS基因第9外显子有明显异常峰形;DNA序列分析进一步发现该外显子发生一新的移码突变,突变部位在第482位密码子(TTA)内,即cDNA第1569bp的T后插入了2个T,致使新肽链提前在第483位遇上终止密码TAA,导致新肽链从原来的550个氨基酸缩短至482个。该患儿为这一突变的半合子,而其母为这一突变的杂合子。结论PCR-DHPLC和DNA序列分析是诊断Hunter综合征的有效方法,发现的移码突变(1569+TT)导致肽链比正常的少了68个氨基酸,从而引起IDS酶活性明显降低,可能是该Hunter综合征患者的致病原因。

突变特异性扩增系统和变性高效液相色谱分析法结合DNA测序法快速产前诊断黏多糖贮积症Ⅱ型高危胎儿

目的为了快速、准确地对黏多糖贮积症Ⅱ型(MPSⅡ)高危胎儿做出产前基因诊断,从而及时而高效地防止病胎的出生。方法在阐明先证者病因及其父母基因型的基础上,采用已建立的突变特异性扩增系统(ARMS)特异引物直接鉴定法、变性高效液相色谱(DHPLC)快速筛检法,结合DNA序列分析法,对已孕20周的高危胎儿的艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)基因相应突变位点进行快速检测和鉴定。由于MPSⅡ为XR病,故又用SRY引物对胎儿进行性别鉴定,以避免可能出现的母血污染而导致的误诊。结果所怀胎儿未获得母源性的c.1344delA突变,是1例基因型完全正常的女胎。后经随访和复检,证实所生小孩的基因型、表现型都与产前诊断结果完全一致。结论 ARMS特异引物直接鉴定法、DHPLC快速筛检法结合DNA序列分析法是快速、准确产前诊断MPSⅡ高危胎儿的有效方法。其中,所建立的ARMS和DHPLC方法,既快速特异,又简便经济,可在一天之内送报结果 ,特别适用于已明确病因的高危胎儿的早期诊断以及正常组和患者试验组的快速鉴别。这一产前基因诊断工作的成功实施为今后继续开展本病以及其他相关遗传病的遗传咨询、基因诊断和产前诊断积累了宝贵的经验,也为今后开展植入前遗传学诊断等打下较好的基础。