艾滋病病毒(HIV)-1、p24抗原和抗体联合检测的临床价值分析

目的分析联合检测艾滋病病毒(HIV)-1、p24抗原与抗体的临床价值。方法纳入本院2018年1月至2018年12月接收进行(HIV)-1、p24抗原与抗体检测患者1 000例血液样本,分别进行(HIV)-1、p24抗原与抗体检测,针对(HIV)-1、p24抗原检测阳性样本检测CD4+T淋巴细胞与RNA,对比分析检测结果。结果 1 000份检测样本中,HIV抗体检测阳性80例、(HIV)-1、p24抗原检测阳性11例,(HIV)-1、p24抗原与抗体联合检测阳性6例。11例(HIV)-1、p24抗原检测阳性样本中,四代酶联试剂检测显示9例HIV抗原、抗体检测阳性,2例检测阴性,进行病毒载量检测均≥20 000拷贝/ml,检测CD4细胞显示<500个/μl样本4例。结论临床应用可区分(HIV)-1、p24抗原与抗体的四代试剂进行检测可提高对HIV感染患者的检出率并缩短检测窗口期,在检测过程中结合应用病毒载量与CD4细胞水平计数检测对于促进检验准确性的提高也具有积极意义。

新疆维吾尔自治区人民医院1999～2001年艾滋病病毒抗体检测疫情漏报调查

艾滋病病毒(HIV)在新疆维吾尔自治区感染流行已进入快速增长期,为了更好地开展艾滋病(AIDS)防治监测工作,掌握医院HIV感染情况,提高疫情报告质量,对新疆维吾尔自治区人民医院近3年HIV疫情调查结果如下.

α1-抗胰蛋白酶、CXCL12、IL-15Rα与艾滋病病毒感染患者预后的相关性分析

目的探究α1-抗胰蛋白酶、CXCL12、IL-15Rα与艾滋病病毒感染患者预后的相关性。方法对154例病理学检测确诊为艾滋病病毒感染患者以及154例健康志愿者进行了研究。按照疾病的分期将患者分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期。使用Western blot法检测α1-抗胰蛋白酶、CXCL12表达,使用PC-PCR检测IL-15Rα表达,使用间接法检测CD3、CD4水平。结果与对照组相比,艾滋病组患者CD4、CD8水平异常下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,艾滋病组患者α1-抗胰蛋白酶、CXCL12、IL-15Rα表达均有所上升(P<0.05);与Ⅰ期患者相比,Ⅱ期患者体内α1-抗胰蛋白酶、CXCL12、IL-15Rα表达升高(P<0.05);与Ⅱ期患者相比,Ⅲ期患者体内α1-抗胰蛋白酶、CXCL12、IL-15Rα表达升高(P<0.05);与Ⅲ期患者相比,Ⅳ期患者体内α1-抗胰蛋白酶、CXCL12、IL-15Rα表达升高(P<0.05)。结论α1-抗胰蛋白酶、CXCL12、IL-15Rα与艾滋病病毒感染病症有着密切的关联,且与艾滋病病毒感染患者预后有着一定的相关性。

马疱疹病毒1型ORF2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

研究旨在克隆马疱疹病毒1型(EHV-1)ORF2基因,通过大肠杆菌原核表达系统获得ORF2蛋白,制备多克隆抗体。根据EHV-1 YM2019株全基因组序列(GenBank:MT063054)设计1对引物,将ORF2基因克隆至pET-28a-ORF2原核表达载体中,通过Transetta(DE3)感受态细胞,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达ORF2蛋白,使用Ni-NTA琼脂糖纯化树脂纯化,免疫BALB/c小鼠,检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示:ORF2基因成功克隆至原核表达载体pET-28a中,并通过大肠杆菌表达系统得到ORF2蛋白,大小约为38 ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA纯化树脂获得纯度较高的重组蛋白,能够与EHV-1阳性血清特异性结合;间接ELISA方法检测多克隆抗体的效价为1∶64000,RK-13表达的ORF2蛋白可被多克隆抗体能特异性识别。研究表明,大肠杆菌表达的ORF2重组蛋白具有良好反应原性,ORF2蛋白制备的多克隆抗体效价高、特异性强,可为ORF2蛋白的生物学功能和基因缺失疫苗的研究奠定基础。

猪戊型肝炎病毒重组蛋白ORF2-V1单克隆抗体的制备及抗原表位差异分析

用纯化的猪戊型肝炎病毒DQ株重组蛋白ORF2-V1免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次克隆和间接ELISA筛选,获得了αC11,αC12,γH1,γF8,BC4和CH86株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过间接ELISA测定,单抗效价为:细胞培养上清1∶1.60×103～1∶3.20×103,腹水为1∶1.28×106～1∶2.56×106;经ELISA法测定,6株单克隆抗体均与重组蛋白ORF2-V1反应,而不与ORF2其它部分片段的蛋白反应;将试验中制备的MAbs分别用HEVswDQ株感染的A549细胞涂片进行IFA检测,同时分别用猪的阳性、阴性血清和SP2/0细胞上清做对照,制备的6株MAbs对感染细胞均呈现阳性反应,说明其可以与天然的病毒发生反应,并且与阳性多克隆血清比较,以单克隆抗体为一抗,IFA反应表现出良好的特异性。单抗的亚类鉴定结果表明,所有MAbs均为IgG1型,而且所有单克隆抗体的轻链均为κ链。单克隆抗体抗原识别位点分析结果表明,6株单抗分别针对4个不同抗原位点,McAb-γH1,BC4,CH8识别的位点各不相同,其中McAb-γH1,BC4识别的位点有部分重叠,McAb-αC11,αC12,γF8识别同一位点,位于γH1,BC4识别位点的重叠区内。

嵌合IL-21的重组溶瘤流感病毒构建及其在肝癌中的溶瘤机制

目的拯救嵌合白细胞介素-21(interleukin-21,IL-21)的重组溶瘤流感病毒,评价其对肝细胞癌的抑制效果及安全性,并探索其联合程序性死亡受体1(programmed cell death-protein 1,PD-1)抗体增强抗肿瘤作用的机制。方法将IL-21基因片段插入流感病毒PR8的非结构蛋白(nonstructural protein,NS)序列,利用反向遗传学(reverse genetics,RG)技术,拯救重组溶瘤流感病毒rOV-IL-21-NS;采用半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infectious dose,TCID50)和血凝实验测定病毒滴度和毒力;采用反转录定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、凝胶电泳和测序分析验证外源基因是否成功插入NS序列;通过透射电镜观察病毒形态特征及大小,采用CCK-8检测其对肝癌细胞活力的影响;建立C57BL/6小鼠肝细胞癌皮下荷瘤模型,将45只8周龄雌性C57BL/6小鼠(体质量16~20 g)按简单随机分组法分为5组(每组9只):PBS组、PR8组、PD-1抗体组、rOV-IL-21-NS组和rOV-IL-21-NS联合PD-1抗体治疗组,以评价单药和联合疗法抗肿瘤效果;通过流式细胞术评价单药和联合疗法对肿瘤免疫微环境的调控作用。结果利用RG技术成功拯救重组溶瘤流感病毒rOV-IL-21-NS,经测序验证了IL-21成功插入目的序列,其可稳定传代,第6代病毒血凝效价达211,病毒滴度达106 TCID50/mL。rOV-IL-21-NS选择性降低肝癌细胞活力而对正常肝细胞无明显影响。相对于PBS组,rOV-IL-21-NS联合PD-1抗体显著抑制小鼠肿瘤的生长(P<0.001),增加脾脏组织中CD4+CD69+T及CD8+CD69+T细胞的比例(P<0.05)。结论嵌合IL-21的重组溶瘤流感病毒rOV-IL-21-NS可有效、安全地靶向杀伤肝癌细胞,协同PD-1抗体进一步增强T细胞活化,改善免疫微环境。

血清富亮氨酸α_(2)糖蛋白1、新蝶呤与病毒抗体检测对病毒性脑膜炎患儿病情评估及预后预测的价值

目的探讨血清富亮氨酸α_(2)糖蛋白1(LRG1)、新蝶呤(NPT)与病毒抗体交互作用在病毒性脑膜炎(VM)患儿病情进展中的作用及其对VM患儿病情评估及预后预测的价值。方法选择2020年8月至2023年2月开封市儿童医院收治的130例VM患儿为观察组,另选择同期收治的130例有VM症状但经腰椎穿刺脑脊液检查确诊为非中枢系统感染性疾病患儿为对照组。入院后采集2组患儿2 mL外周静脉血,采用酶联免疫吸附法检测血清LRG1、NPT水平;治疗前行腰椎穿刺,采集1 mL脑脊液标本,采用酶联免疫吸附法检测脑脊液中单纯疱疹病毒Ⅰ(HSV-Ⅰ)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、副流感病毒(PIV)的特异性IgG抗体。比较2组患儿的血清LRG1、NPT水平及病毒抗体IgG阳性率。依据病情严重程度将VM患儿分为轻症组(n=76)和重症组(n=54),依据治疗2周后的预后将VM患儿分为预后良好组(n=37)和预后不良组(n=93);比较不同病情严重程度组、不同预后组患儿血清LRG1、NPT水平及病毒抗体IgG阳性率,分析血清LRG1、NPT和病毒抗体与VM患儿病情严重程度、病情进展的相关性,并分析其对VM患儿病情进展的交互作用,采用受试者操作特征(ROC)曲线分析血清LRG1、NPT与病毒抗体对VM患儿预后的预测价值。结果观察组患儿血清LRG1、NPT水平及病毒抗体IgG阳性率均显著高于对照组(P<0.05);重症组患儿血清LRG1、NPT水平及病毒抗体IgG阳性率均显著高于轻症组(P<0.05);预后不良组患儿血清LRG1、NPT水平及病毒抗体IgG阳性率均显著高于预后良好组(P<0.05)。高血清LRG1水平与高病毒抗体IgG阳性率、高血清NPT水平与高病毒抗体IgG阳性率导致VM患儿预后不良中呈正向交互作用(比值比:15.238、9.684);血清LRG1高表达与高病毒抗体IgG阳性率(比值比:15.238)、血清NPT高表达与高病毒抗体IgG阳性率(比值比:9.684)为次相乘模型。血清LRG1、NPT水平与病毒抗体IgG阳性率预测治疗2周VM患儿预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.786、0.794、0.919,三者联合预测的AUC为0.933;LRG1、NPT与病毒抗体IgG阳性率联合预测治疗2周VM患儿预后不良的AUC大于三者单独预测(P<0.05)。结论NPT、LRG1可能参与了VM的发生发展,血清NPT、LRG1水平与VM患儿病情严重程度、病情进展均呈正相关,血清NPT、LRG1水平及病毒抗体IgG阳性率对VM的病情评估及预后预测有一定价值,且三者联合对VM预后的预测价值更高;VM患儿高LRG1与高病毒抗体IgG阳性率、高NPT与高病毒抗体IgG阳性率同时存在时具有正向交互作用。

吸毒人群尿液、血液平行检测艾滋病病毒1型抗体结果分析

目的 利用吸毒人群尿液和血液标本比较不同方法检测艾滋病病毒1型(HIV-1)抗体结果的一致性。方法 平行采集强制戒毒所234名吸毒者的尿液和血液标本,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)分别测定不同标本中HIV-1抗体。结果234人中5人血液标本HIV-1抗体为阳性,其平行尿液标本中4人阳性,另1人蛋白印迹试验确认为阴性。结果显示:两种标本检测HIV-1抗体的符合率为99.6％。结论 尿液标本ELISA试剂的检测结果是可靠的。

艾滋病病毒-1型感染艾滋病患者载毒数量的作用及与常见机会感染发生的关系

目的探讨艾滋病病毒-1型(HIV-1)感染艾滋病患者病毒载量的作用及与常见机会感染发生的关系。方法选取艾滋病患者110例,采用流式细胞仪检测患者CD_4^+T细胞计数,采用全自动病毒载量仪检测患者HTV-1病毒载量。结果 110例患者中,HIV-1病毒载量(Log_(10))为1.43~6.51,平均为(4.41±1.02);CD_4^+T淋巴细胞<200个/μl者53例,≥200个/μl者57例。CD_4^+/T淋巴细胞<200个/μl患者HIV-1病毒载量明显高于CD_4^+T淋巴细胞≥200个/μl患者(P<0.05)。Spearman相关分析显示HIV-1病毒载量与CD_4^+T淋巴细胞水平呈负相关(r_s=-0.324,P<0.05)。病毒载量(Log_(10))<4.41组和≥4.41组口腔假丝酵母菌感染、细菌性肺炎、肺结核以及总机会感染发生比例差异无显著性(P>0.05)。CD_4^+T细胞<200个/μl AIDS患者机会感染发生率为89.47%,明显高于≥200个/μl患者。结论 HIV-1感染AIDS患者病毒载量与机会性感染无明显关系,但与患者CD_4^+T淋巴细胞数有关,而CD_4^+T淋巴细胞数与机会性感染有明显关系。

H5N1禽流感病毒PB1-F2特异性单克隆抗体的制备与鉴定

以重组的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)PB1-F2的C端蛋白(cPB1-F2)为免疫原制备单克隆抗体,并鉴定其特异性。构建cPB1-F2的pGEX-6p-1原核表达载体,进行蛋白表达与纯化;采用杂交瘤技术制备筛选抗重组cPB1-F2蛋白的杂交瘤细胞株,利用间接免疫荧光和酶联免疫吸附试验筛选鉴定阳性细胞株,并对单克隆抗体特异性进行鉴定。结果显示,纯化的重组cPB1-F2蛋白具有良好的免疫原性,筛选获得了3株稳定分泌抗cPB1-F2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6F4、2C5和4D3,经鉴定抗体均为IgG1亚类,且3株单克隆抗体均能特异性识别重组PB1-F2蛋白。结果表明成功制备了cPB1-F2特异性单克隆抗体,为研制针对流感病毒的抗体药物奠定了基础。

人类免疫缺陷病毒,艾滋病病毒1型艾滋病患者CD4^+T淋巴细胞水平与机会感染及病毒载量的相关性分析

目的分析人类免疫缺陷病毒,艾滋病病毒-1(HIV-1)型艾滋病(AIDS)患者体内CD4^+T淋巴细胞水平与艾滋病病毒载量及机会性感染的相关性。方法通过Real-time PCR OBASAmpliPrep/COBAS TaqMan全自动病毒载量仪(Roche公司)和流式细胞仪(FACSCOUNT)绝对计数法对95例HIV-1型AIDS患者定量检测血浆中HIV-1 RNA和CD4^+T淋巴细胞数。结果低文化程度的35~50岁已婚男性农民是HIV-1型AIDS患者的多见人群,主要通过性传播途径感染;机会感染最常见部位是呼吸系统感染90例次(51.5%);机会感染发病率最多的是细菌性肺炎48例次(27.4%);根据CD4^+T淋巴细胞计数分层水平分为5组,细菌性肺炎、卡氏肺孢子虫肺炎、肺结核、口腔念珠菌感染、隐球菌脑膜炎、感染性腹泻及单纯疱疹各自在5组间比较差异有统计学意义(P<0,05),其余机会感染各自在5组间比较差异无统计学意义(P>0.05);CD4^+T细胞计数低于200个/μl时,机会感染发生例次率为97.7%;病毒量<103拷贝/ml的AIDS中,以CD4^+T细胞数在200~399个/μl的个体较多(75%),病毒量≥10~5拷贝/ml的AIDS中,CD4^+T细胞数在<200个/μl的个体45例(73.8%);CD4^+T淋巴细胞值与病毒载量对数值呈负相关(r=-0.34,P<0.01)。结论AIDS患者机会性感染的发生率高,随病毒载量上升CD4^+T淋巴细胞数呈现不同程度的下降趋势,CD4^+T细胞计数是AIDS患者发生机会性感染的独立危险因素,加强对患者CD4^+T细胞计数观察是预测机会性感染的重要手段。

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒(Goose astrovirus 1,GAstV-1)结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1∶128000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。【结论】原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。

人β_2糖蛋白1的重组表达及对抗磷脂抗体综合征患者血清诱导内皮细胞产生ICAM-1的影响

目的:探讨重组人β2糖蛋白1(hrβ2-GP1)对抗磷脂抗体综合征(APS)患者血清诱导内皮细胞系产生细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的影响。方法:应用pQE30表达载体表达hrβ2-GP1,Western blotting对重组蛋白进行鉴定;应用hrβ2-GP1处理前后的APS患者血清分别与内皮细胞株EA.hy926共孵育,细胞ELISA和RT-PCR方法分析处理前后EA.hy926表达ICAM-1的变化。结果:成功构建pQE30-hβ2-GP1,并对表达产物进行了纯化和鉴定,所获得的蛋白与预期的大小一致,并具有人β2-GP1的抗原性;rhβ2-GP1处理后的APS患者血清与处理前比较,与其孵育的内皮细胞系EA.hy926表达ICAM-1在蛋白和mRNA水平均明显降低,这种抑制作用随着rhβ2-GP1的浓度增加而逐渐增强。结论:抗β2糖蛋白1抗体(anti-β2GP1)促进内皮细胞系EA.hy926表达ICAM-1,hrβ2-GP1可中和此作用。

氧化修饰的β_2-糖蛋白-1诱导抗心磷脂抗体的产生

目的：探讨蛋白质的氧化修饰与体内抗磷脂抗体产生的关系。方法：首先，在体外以次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧化系统氧化大鼠β_2-GP1，然后以氧化的β_2-GP1（oxβ_2－GP1）免疫同种大鼠，最后以ELISA方法检测被免疫大鼠β_2-GP1血清中的抗心磷脂抗体（ACA）。结果：氧化的β_2-GP1免疫的大鼠血清中产生高滴度的ACA。结论：β_2－GP1的氧化修饰在ACA的产生上可能起十分重要的作用。

重组鸡痘病毒表达的鸡IL-1β和IL-2以及cMGF对新城疫LaSota疫苗免疫效果的影响

将128只10日龄SPF鸡随机分成8组,每只免疫1 PD_(50)的新城疫LaSota疫苗；同时Ⅰ～Ⅵ组鸡分别皮下注射不同剂量的重组鸡痘病毒rFPV-IL-1β、rFPV-IL-2或cMGF,而Ⅶ组和Ⅷ组鸡分别皮下注射鸡痘病毒wt-FPV和PBS作为阴性对照和空白对照。结果,重组鸡痘病毒表达的IL-1β、IL-2或cMGF可以消除鸡痘病毒在免疫后第7d对雏鸡体重增长的影响；一定剂量的IL-1β和IL-2可使鸡脾中CD4^+T细胞在免疫后第7d和CD8^+T细胞在免疫后第14d的总体水平提高；免疫第21d新城疫F48E8强毒攻毒后,一定剂量的IL-1β和IL-2能提高免疫保护率,而cMGF却无此作用。结果表明,重组鸡痘病毒表达的IL-1β和IL-2在一定剂量下可增强新城疫LaSota疫苗的免疫效果。

HIV-1 CRF01_AE重组型gp120 V1/V2结构域单克隆抗体的制备与鉴定

目的真核表达人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CRF01_AE重组型gp120蛋白的V1/V2结构域,制备其单克隆抗体并鉴定其抗原反应性。方法构建pTriEx-3-V1/V2CNE55真核表达载体,在HEK293F细胞中表达V1/V2-His融合蛋白,纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选分泌抗V1/V2重组蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤,对单克隆抗体的特异性、型别以及效价进行鉴定。结果制备并获得一株稳定分泌抗HIV-1 AE亚型V1/V2结构域单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA测定腹水效价高达1∶81 000,单克隆抗体类型属于IgG1/κ型。Western blot结果表明该单克隆抗体同样能够识别不同亚型的HIV gp120蛋白。结论成功制备出抗HIV-1 AE重组型gp120蛋白V1/V2结构域的单克隆抗体。

抗-β2糖蛋白1抗体在女性不孕症及先兆性流产中的检测及意义

目的：探讨抗-β2糖蛋白1抗体与女性不孕、先兆流产和月经紊乱之间的关系。方法选取2013年8月～2014年1月在海军总医院辅助医学生殖中心就诊的女性不孕症患者547例、先兆流产患者229例、妇科月经紊乱患者60例和正常孕龄女性31例。应用酶联免疫吸附法（ELISA）对各组的抗-β2糖蛋白1抗体（aβ2GP1）进行检测分析，包括抗-β2糖蛋白1抗体-IgM（aβ2GP1-IgM）和抗-β2糖蛋白1抗体-IgG（aβ2GP1-IgG）。同时选取114例不孕不育及先兆流产患者，检测其经阿司匹林、强的松治疗前后的抗-β2糖蛋白1抗体（Ig-G／Ig-M）。结果健康组、女性不孕组、先兆流产组和月经紊乱组抗-β2糖蛋白1抗体-IgG 的阳性率分别是0％，0.36％，0.43％和1.6％；健康组、月经紊乱组、先兆流产组和女性不孕组抗-β2糖蛋白1抗体-IgM 的阳性率为3.2％，8.3％，19.21％和20.29％，女性不孕组、先兆流产组抗-β2糖蛋白1抗体-IgM抗体与对照组差异均具有统计学意义（χ^2＝4.87～5.27，P 值均＜0.05）；女性不孕组经阿司匹林联合强的松治疗前后抗-β2糖蛋白1抗体-IgM（47.14±34.85 RU／ml 和31.14±27.64 RU／ml）和抗-β2糖蛋白1抗体-IgG（1.81±3.63 RU／ml 和1.14±1.99 RU／ml），差异具有统计学意义（P 值均＜0.01），先兆流产组经阿司匹林联合强的松治疗前后抗-β2糖蛋白1抗体-IgM（37.75±31.20 RU／ml 和24.34±24.48 RU／ml）差异具有统计学意义（P 值均＜0.01），抗-β2糖蛋白1抗体-IgG （1.45±1.76 RU／ml 和1.32±1.52 RU／ml）差异无统计学意义（P 值＝0.718）。结论抗-β2糖蛋白1抗体-IgM 与女性不孕不育及先兆流产有密切相关性，是引起女性不孕及先兆流产的重要因素。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7片段互换嵌合病毒的构建及其生物学特性的分析

为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)强弱毒之间毒力差异的分子基础,本实验分别以HP-PRRSV强毒HuN-F5株及其传代致弱的疫苗病毒株HuN4-F112为亲本病毒,利用反向遗传操作技术分别将ORF1a、ORF1b或ORF2-7编码序列在强弱毒之间互换。将6种含有不同嵌合基因的全长病毒基因组的重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中传代,拯救的重组病毒经RT-PCR、测序和免疫荧光鉴定,并分别命名为rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7(以强毒为骨架)和rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7(以弱毒为骨架)。进一步测定这些病毒在Marc-145上的生长曲线,结果显示:以强毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著高于亲本强毒rHuN4-F5,而以弱毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F112-ORF1a在细胞上的生长滴度低于其亲本弱毒rHuN4-F112,其他片段替换对病毒在细胞上的生长没有明显影响。本实验结果提示ORF1a对于PRRSV在体外细胞培养上的生长调节起重要作用。

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定(英文)

目的在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上,制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段S1c(N端249-667氨基酸残基),其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定1株为IgG1,2株为IgG2a,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体,为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。

共表达口蹄疫病毒VP1-2A基因与猪IL-2重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

构建共表达口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因和猪白细胞介素2(IL-2)基因的重组腺病毒,并研究重组病毒对小鼠特异性免疫的影响。将FMDV VP1-2A基因和猪IL-2基因先后克隆到腺病毒的穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP中,在受体菌中与腺病毒骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3同源重组。重组腺病毒质粒转染HEK-293A细胞,得到重组腺病毒rAd5VP1-2A-Po IL-2。MTT法检测重组IL-2的生物活性。用rAd5VP1-2A-poIL-2免疫接种小鼠,同时设免疫单独表达FMDV VP1基因的重组腺病毒rAd5VP1和空腺病毒的对照组。通过检测淋巴细胞增殖功能,特异性抗体分泌,IL-4和IFN-γ的表达水平衡量rAd5VP1-2A-poIL-2对小鼠特异性免疫应答的影响。结果显示,成功获得了rAd5VP1-2A-poIL-2,MTT法检测重组IL-2具有生物学活性。小鼠免疫试验结果显示,与rAd5VP1免疫组相比,rAd5VP1-2ApoIL-2免疫既能增强重组病毒诱导小鼠淋巴细胞增殖的能力,又能提高重组病毒诱导小鼠特异性抗体的水平。细胞因子检测结果显示,串联IL-2能促进重组病毒诱导Th1和Th2的分化。研究结果说明,rAd5VP1-2A-poIL-2可望成为口蹄疫的候选疫苗。