柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG12对鸡的免疫保护效果评价

为评估柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)表面抗原(Surface antigen,SAG)SAG12对鸡的免疫保护效果,首先构建EtSAT12/pET-32a原核表达载体,对EtSAG12重组蛋白进行纯化并制备多克隆抗体;然后进行动物试验,将100只1日龄海兰灰雏公鸡分成5个组,分别是感染对照组(PC)、空白对照组(NC)、EtSAG12重组蛋白50μg、100μg和150μg组。通过统计相对增质量率、卵囊减少率、抗球虫指数(ACI)和血清中特异性IgG抗体等指标评价EtSAG12重组蛋白的免疫保护效果。结果显示:成功表达出EtSAG12重组蛋白,大小约为43 Ku,主要以可溶性形式表达;Western Blot结果显示所制备的多克隆抗体有较强的特异性。免疫保护试验结果显示:与PC组相比,3个重组蛋白组的平均增质量显著增加(p<0.05)、病变计分显著降低(p<0.05),且均能有效降低卵囊产量,其中重组蛋白150μg组相对增质量率(97.34%)和卵囊减少率(52.54%)均为最高,ACI值达到165.34,具有中效抗球虫效果;3个重组蛋白组血清中特异性IgG抗体水平与PC组和NC组相比,在p<0.05水平差异均有统计学意义,且二免7 d后血清中特异性IgG抗体水平达到最高,其中重组蛋白150μg组特异性IgG抗体水平最高,且显著高于另外两个重组蛋白组(p<0.05)。综上所述,EtSAG12重组蛋白能减轻因球虫感染导致的增质量损失和肠道病变,减少卵囊排出,刺激宿主产生体液免疫,具有一定的免疫保护作用。

柔嫩艾美耳球虫感染鸡盲肠内容物非靶向代谢组学分析

【目的】基于非靶向代谢组学探究感染柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)后鸡盲肠内容物中代谢物的变化差异,为识别和鉴定鸡球虫病潜在的生物标志物及治疗靶点提供参考依据。【方法】将60羽健康罗曼粉鸡随机分为正常组和模型组,每组30羽,模型组经口灌服柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊(1×104个/羽),正常组经口灌服等体积生理盐水,连续灌服5 d,然后解剖试验鸡,无菌采集鸡盲肠内容物,基于非靶向代谢组学分析正常组和模型组鸡盲肠内容物,筛选出显著差异代谢物进行KEEG代谢通路富集分析。【结果】从模型组与正常组的鸡盲肠内容物中共筛选到253种显著差异代谢物,其中,上调表达的显著差异代谢物有184种,包含L-酪氨酸、L-蛋氨酸、L-谷氨酰胺、牛磺酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸乙酯、胆碱和磷酸胆碱等;下调表达的显著差异代谢物有69种,包括脱氧腺苷、L-缬氨酸、N-(5-氨基戊基)乙酰胺和N-乙酰-L-谷氨酸等。正离子模式下,主要有牛磺酸、磷酸胆碱、甜菜碱、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、胆碱、神经鞘氨醇和L-色氨酸等20种代谢物上调表达;负离子模式下,主要有花生四烯酸、牛磺酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、琥珀酸、黄嘌呤、尿嘧啶和L-谷氨酰胺等20种代谢物上调表达。鸡盲肠内容物显著差异代谢物主要被富集到ABC转运蛋白、氨酰tRNA生物合成、赖氨酸降解、嘧啶代谢、嘌呤代谢、不饱和脂肪酸生物合成等20条KEEG代谢通路上。【结论】柔嫩艾美耳球虫感染后鸡盲肠代谢物发生显著变化,主要影响ABC转运蛋白、氨酰tRNA生物合成、氨基酸代谢、嘧啶代谢和嘌呤代谢等代谢通路。因此,牛磺酸、磷酸胆碱、L-谷氨酰胺、花生四烯酸等显著差异代谢物可作为潜在的生物标志物,用于鸡球虫病诊断检测。

玉屏风加减煎剂对德化黑鸡柔嫩艾美耳球虫的抗感染效果

【目的】探明玉屏风加减煎剂对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染德化黑鸡抗氧化、抗炎、免疫功能的影响及抗球虫效果。【方法】将120只45日龄德化黑鸡随机分为6组,分别是空白对照组(K组)、感染对照组(G组)、常山青蒿低剂量组(CQL组)、玉屏风加减低剂量组(YL组)、常山青蒿高剂量组(CQH组)、玉屏风加减高剂量组(YH组),除空白对照组外,其余各组均感染柔嫩艾美耳球虫,24 h后开始连续7 d饮水给药,第8 d测定比较各组抗球虫指数、免疫功能、抗氧化能力等指标的差异。【结果】与感染对照组(G组)相比,中药处理组CQH、YH、CQL、YL的血便、盲肠病变症状依次减轻。除CQH组外,其他组盲肠病变计分、盲肠黏膜下淋巴细胞密度显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01);除CQH组OPG显著下降(P<0.05)外,其他3个中药组OPG下降极显著(P<0.01);YL组和YH组盲肠上皮细胞脱落计分极显著降低(P<0.01)。与CQL、CQH组相比,YL、YH组MDA、盲肠病变计分、盲肠上皮细胞脱落计分和OPG下降极显著(P<0.01)。与G组相比,4个中药组IL-6、 IFN-γ、TNF-α、丙二醛(MDA)含量极显著降低(P<0.01),而IL-2含量、 SIgA水平、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、总抗氧化能力(T-AOC)极显著升高(P<0.01);YL组IL-2含量、 SIgA水平、GSH-Px活性、SOD活性、CAT活性极显著增高(P<0.01),YH组GSH-Px、 SOD活性极显著升高(P<0.01)。与K组相比,G组、CQL组、YL组、CQH组、YH组的相对增重率分别是79.88%、 103.49%、 107.27%、 95.05%、 96.06%,抗球虫指数(anti-coccidialindex,ACI)分别是96、165.5、177、133.5、162.5。【结论】玉屏风加减煎剂对人工感染柔嫩艾美耳球虫德化黑鸡具有更好抗炎、抗氧化、提高免疫功能的免疫调节作用,并相应具有更好的抗球虫效果,且以玉屏风加减低剂量组(YL)抗球虫效果最好。

柔嫩艾美耳球虫莫能菌素耐药株筛选及其与敏感株基因组SNP密度分布差异分析

【目的】明确莫能菌素耐药虫株与敏感虫株在基因水平的差异,进而解析莫能菌素耐药性产生的分子机制。【方法】通过模拟田间感染的方式诱导柔嫩艾美耳球虫对莫能菌素的耐药性。第1次诱导试验,将400只14日龄无球虫鸡平均分为2组,分别为Ⅰ组(接种不加药组)和Ⅱ组(莫能菌素推荐剂量组),按照100 mg/kg在基础饲粮中添加莫能菌素。从Ⅰ组中随机选择10只鸡,接种对莫能菌素敏感的柔嫩艾美耳球虫豪顿株,剂量为5000卵囊/鸡。自接种后8 d开始,将Ⅰ组新鲜粪便抛洒到Ⅱ组垫料上模拟球虫田间感染,连续抛洒17 d。接种后33 d,随机剖检Ⅱ组10只鸡,收集盲肠内卵囊。第2次诱导试验,将100只14日龄无球虫鸡作为Ⅲ组(莫能菌素高剂量组),按照133 mg/kg在饲料中添加莫能菌素,随机选择10只鸡接种收集的卵囊,剂量为5000卵囊/鸡。接种后17 d,莫能菌素添加量提高至400 mg/kg。接种后27 d,收集盲肠卵囊。以抗球虫指数(ACI)、病变记分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)和最适抗球虫活性百分率(POAA)四项指标综合判定诱导株的耐药性。提取耐药株或敏感株孢子化卵囊基因组并进行基因组重测序,通过单核苷酸多态性(SNP)密度分布解析耐药株与敏感株之间的差异。【结果】第1次诱导试验,接种后33 d获得耐100 mg/kg莫能菌素的卵囊(1×莫能菌素诱导株)。第2次诱导试验,接种后27 d获得耐400 mg/kg莫能菌素的卵囊(4×莫能菌素诱导株)。4×莫能菌素诱导株的ACI为121,POAA为25.4%,RLS为33%,POP为64%。与参考基因组相比,敏感株基因组SNP共12191个,耐药株基因组SNP共74931个,耐药株在第11号染色体3.3~4.2 Mb区间内SNP富集分布,该区间内3个基因ETH2_1113700、ETH2_1113500和ETH2_1113600的SNP位于编码区。【结论】本研究获得了对莫能菌素完全耐药的柔嫩艾美耳球虫耐药株。在第11号染色体,耐药株与敏感株的SNP分布具有显著差异,筛选到3个耐药候选基因。

常山散对雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的防治效果

旨在研究中药常山散对雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段抗球虫效果和免疫功能的影响。试验设置6大组,分别为攻虫前1天、攻虫当天、第2天、第3天、第4天和第5天给药时间点设计组,每个设计组包括3个处理组,分别为Ⅰ组(健康对照组)和Ⅱ组(感染对照组),饲喂基础饲粮;Ⅲ组(常山散推荐剂量组),按照0.1g·kg^(-1)在基础饲粮中拌料饲喂,连续给药4 d,每组10只鸡,共180只。16日龄时,Ⅱ组和Ⅲ组每只鸡口服5×10^(4)个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊。结果表明:与Ⅰ组相比,Ⅲ组的日均增重(average dialy gain, ADG)在球虫发育前期(攻虫前1天、攻虫当天)差异不显著(P>0.05),发育后期显著降低(P<0.05),Ⅱ组在球虫发育的整个时期ADG均显著降低(P<0.05),降低幅度大于Ⅲ组。与Ⅰ组相比,Ⅱ组和Ⅲ组的日均采食量(average daily feed intake, ADFI)有所下降,其中Ⅱ组下降最为明显,Ⅲ组有所改善。与Ⅱ组相比,中药常山散显著(P<0.05)降低感染雏鸡每克粪便卵囊数(oocysts per gram, OPG)。球虫感染破坏盲肠黏膜的完整性,使盲肠肌膜增厚。中药常山散可减轻球虫感染引起的肠黏膜损伤。与Ⅱ组相比,饲粮中添加常山散可降低盲肠病变评分(P<0.05)。攻虫前1天、攻虫当天和第2天试验组中Ⅲ组的抗球虫指数(anticoccidial index, ACI)分别为198.83、190.23、165.49,攻虫第3、4和5天试验组中Ⅲ组的ACI分别为150.53、155.00和146.18,说明在球虫发育的前期给药,常山散具有良好的抗球虫效果,后期随着球虫在鸡体内的发育,常山散的治疗效果降低。与Ⅱ组相比,常山散增加血液中免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量,提高脾脏指数和法氏囊指数。综上所述,常山散可改善感染雏鸡的生长性能,显著降低感染雏鸡OPG和盲肠病变评分,增强感染雏鸡免疫功能。

毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX的原核表达与分析

旨在研究毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX的反应原性及其在虫体内的亚细胞定位。提取毒害艾美耳球虫(扬州株)配子体总RNA,RT-PCR扩增En GPX的ORF编码序列,构建原核表达质粒pET-28a(+)-En GPX,转化至BL21(DE3)进行体外诱导表达,同时制备鼠抗rEnGPX多克隆抗体,对重组蛋白进行Western blot反应原性分析和激光共聚焦免疫荧光定位分析。结果表明,En GPX ORF序列全长753 bp,编码250个氨基酸,体外重组表达蛋白大小约30 ku,主要以包涵体形式存在。该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体,鼠抗rEnGPX多克隆抗体,毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别,表明其具有较好的反应原性和交叉反应原性。在天然配子体蛋白中检测出EnGPX,其编码蛋白主要分布于配子体内的Ⅱ型成壁体(WFBII)及卵囊壁上。本研究成功克隆表达了毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX,验证其具有良好的反应原性,并定位于配子体及卵囊壁上。以期为研究En GPX参与卵囊壁形成的分子机制提供新的线索,也为研制新型球虫亚单位疫苗提供新的靶标。

巨型艾美耳球虫感染对鸡Toll样受体的影响

为了探究巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)感染对宿主局部免疫组织盲肠扁桃体和系统免疫组织(脾脏和外周血)中Toll样受体(Toll like receptor,TLR)的影响,用巨型艾美耳球虫感染雏鸡,感染后第0、3、7和11天,采集鸡盲肠扁桃体、外周血和脾脏淋巴细胞,用实时荧光定量PCR检测上述组织中8种鸡TLR的mRNA水平变化。结果显示:TLR4和TLR21 mRNA水平在3种组织中无显著变化;TLR2 mRNA水平在感染后第3天开始在外周血和脾脏中显著下降(P<0.05),在盲肠扁桃体中第3和7天无显著变化,在第11天显著上升(P<0.01)。TLR1、TLR3、TLR5、TLR7和TLR15 mRNA水平在3种组织中显著上升(P<0.05),但应答时间有所差异,具体为TLR1和TLR3 mRNA水平在盲肠扁桃体中在第3天开始上升,而在外周血和脾脏中第7天开始上升;TLR5和TLR15 mRNA水平在外周血和脾脏中第3天开始上升,而在盲肠扁桃体中第7天开始上升。结果表明:巨型艾美耳球虫感染上调宿主3种组织中的TLR1、TLR3、TLR5、TLR7和TLR15 mRNA水平,下调外周血和脾脏中的TLR2 mRNA水平;盲肠扁桃体TLR1和TLR3 mRNA水平上升早于外周血和脾脏,而其TLR5和TLR15 mRNA水平上升晚于外周血和脾脏。本研究为揭示鸡TLR在抗球虫感染中的作用提供依据,也为揭示鸡球虫先天性免疫机制提供参考。

巨型艾美耳球虫Th1类细胞因子刺激性分子EmARM-β对鸡PBMC和T细胞亚群免疫功能的影响

[目的]本文旨在探讨巨型艾美耳球虫Th1类细胞因子刺激性分子Armadillo/β-catenin样重复序列蛋白(EmARM-β)对鸡免疫细胞功能的影响。[方法]利用密度梯度离心法和免疫磁珠分选法分别分离出鸡外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、CD8^(+)T细胞和CD4^(+)CD25^(-)T细胞,之后将EmARM-β重组蛋白(rEmARM-β)分别与上述细胞进行体外共孵育6 h,利用CCK-8试剂和qPCR法分别检测并分析其对上述细胞增殖能力及相关细胞因子分泌水平的影响。[结果]经免疫磁珠分选后,流式细胞术检测鸡CD8^(+)T细胞和CD4^(+)CD25^(-)T细胞的纯度分别为93.01%和88.88%。与对照组相比,rEmARM-β显著促进鸡PBMC的增殖能力,显著上调Th1类细胞因子(ifn-γ和il-2)和促炎性细胞因子(il-1β、il-6和il-17a)mRNA水平;显著促进CD8^(+)T细胞的增殖能力,显著上调其ifn-γ、il-2和tnf-α mRNA水平,显著上调穿孔素、fasl(Fas配体)和fas mRNA水平;能显著促进CD4^(+)CD25^(-)T细胞的增殖能力,显著上调其ifn-γ和il-2 mRNA水平,下调il-4和il-10 mRNA水平。[结论]EmARM-β可以有效促进鸡PBMC和T细胞亚群(CD8^(+)T细胞和CD4^(+)CD25^(-)T细胞)的增殖能力,提升其Th1类细胞因子和促炎性细胞因子的分泌水平,提示EmARM-β具有研发鸡球虫病新型疫苗候选抗原的潜力。

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白EtRON2_(L2)特性与功能初步分析

利用RT-PCR、间接免疫荧光实验、免疫印迹实验、抗体中和实验以及BiFC等方法对柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2同源分子—Et RON2_(L2)的特性和功能进行研究。结果发现Et RON2_(L2)氨基酸序列与常规的Et RON2仅有26.63%的同源性,mRNA水平在第二代裂殖子中最高,而蛋白水平在第二代裂殖子和子孢子阶段最高;Et RON2_(L2)在游离的第二代裂殖子和子孢子阶段主要分布于胞质,而在入侵后子孢子中主要分布于虫体表面;抗rEt RON2_(L2)多克隆血清处理组明显抑制子孢子入侵细胞;Et RON2_(L2)与EtAMA3之间存在互作关系。本研究为探究Et RON2_(L2)在球虫入侵过程中的作用机制奠定基础。

柴胡皂苷体内外抗鸡柔嫩艾美耳球虫的研究

为了探究柴胡皂苷对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)体内外感染的影响,本实验采用CCK-8法检测2倍倍比稀释(0.384 g/L~0.0645 g/L)的柴胡皂苷对MDBK细胞活力的影响,结果显示,浓度为0.0645 g/L的柴胡皂苷对MDBK细胞的活力影响最小,并且可以促进细胞的生长,因此以该浓度的柴胡皂苷进行后续试验。本研究设置阴性对照组(NC)、E.tenella感染组(PC)、磺胺嘧啶钠对照组(WM)以及柴胡皂苷治疗组(CA)。除NC组外,每组细胞加入1.6×10^(6)个E.tenella子孢子,4 h后WM组加入0.5 g/L磺胺嘧啶钠,CA组加入0.0645 g/L柴胡皂苷,继续培养至不同时间,分别提取4组细胞蛋白,通过western blot检测感染E.tenella的MDBK细胞中p65蛋白的磷酸化水平;采用荧光定量PCR(qPCR)检测4组细胞中炎症因子的转录水平。Western blot结果显示,培养至24 h时,4组细胞中p65蛋白磷酸化水平均无显著差异;感染48 h与72 h时,与WM和PC组相比,CA组细胞中p65蛋白磷酸化水平极显著降低(P<0.001),但与NC组之间无显著差异(培养48 h)和极显著高于NC组(P<0.001,培养72 h)。qPCR结果显示,培养24 h和48 h,各组细胞中各细胞因子的相对转录水平虽有不同,但在培养72 h时,与PC组和WM组相比,CA组MDBK细胞中促炎因子IL-1β、IL-8、TNF-αmRNA的转录水平极显著降低(P<0.001);24 h时,CA组细胞中抑炎因子IL-10 mRNA的转录水平极显著低于WM组(P<0.0001),但在48 h和72 h时,IL-10 mRNA的转录水平逐渐升高,并极显著高于其他3组(P<0.0001)。将13日龄白羽肉鸡设为上述4个组。除NC组外,每组雏鸡均口服感染2×10^(4)个E.tenella孢子化卵囊。感染后2 d,CA组雏鸡口服0.0645 g/L柴胡皂苷,1 mL/只,WM组雏鸡口服0.5 g/L磺胺嘧啶,1 mL/只,共服用7 d。感染后4 d~8 d,采用血球计数板计算每组鸡粪便卵囊排出率。感染后8 d将各组鸡称重后剖杀,观察盲肠的剖检病变,并通过计算各组肉鸡的相对增重率、存活率、卵囊值以及盲肠病变值计算每组雏鸡的抗球虫指数(ACI);分别于感染后4 d、6 d和8 d分别剖杀10只鸡,取盲肠组织制备病理切片,观察各组鸡盲肠组织的病变。结果显示,CA组鸡粪便卵囊排出率为22.00%,极显著低于PC组(P<0.0001),极显著高于WM组(P<0.0001);ACI为173.13,极显著高于PC组和WM组(P<0.0001),达到中效抗球虫水平;剖检病变观察可见PC组雏鸡的盲肠肠壁变薄,长度变短,高度肿胀,而CA组鸡盲肠肠壁逐渐恢复正常形态,与WM组雏鸡盲肠改善结果接近;组织病变可见,与PC组和WM组相比,CA组盲肠无炎性细胞浸润且肠绒毛肠壁形态完整,未观察到E.tenella裂殖子。以上结果首次证实柴胡皂苷在体内外均可有效抑制E.tenella对细胞的感染,并且能够改善与修复E.tenella对雏鸡盲肠的损伤,本研究为天然中药成分用于治疗E.tenella的感染提供参考依据。

3种兔艾美耳球虫rDNA ITS序列测定与系统进化分析

为研究内转间隔区(ITS)序列能否作为鉴别不同种兔球虫的分子标记,本试验以兔肠艾美耳球虫、黄艾美耳球虫和大型艾美耳球虫为研究对象,对其核糖体DNA(rDNA)ITS全序列进行PCR扩增,扩增产物纯化后连接至pGEM-T Easy载体上,重组质粒通过菌液PCR鉴定后测序,将测序结果与GenBank中公布的兔球虫ITS序列进行同源性比对,用Mega 5.0绘制系统进化树。结果显示,兔肠艾美耳球虫、黄艾美耳球虫和大型艾美耳球虫ITS序列长度分别为1065、1009和1047bp,与GenBank公布的同种球虫相应序列同源性分别为99.2%、99.0%和94.5%,与其他种球虫序列的同源性为55.3%~82.1%。系统进化树显示兔球虫ITS序列形成单系群,该单系群又根据卵囊外残体的有无分为2个亚群。研究结果表明ITS序列种内同源性高于种间同源性,可作为3种兔球虫种间鉴定的分子标记。

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，２００２３２）鸡感染球虫后会产生一种抵抗再次感染的免疫反应，这种免疫反应具有种的特异性，即感染某种球虫不能保护抵抗另...

毒害与巨型及毒害与柔嫩艾美耳球虫间在免疫方面的相互影响

本研究以黄羽肉鸡为实验动物,以死亡率、平均肠道病变记分、平均增重、相对增重率、相对卵囊产量、抗体水平等为评价指标,分别研究了毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫(两者在裂殖生殖阶寄生部位相同)、毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫(两者在配子生殖阶段寄生部位相同)间在免疫上的相互影响。结果显示:毒害艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫混合免疫的保护效果比毒害艾美耳球虫单独免疫好,虽略低于巨型艾美耳球虫单独免疫,但仍具有免疫保护性;毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫混合免疫的保护效果比毒害艾美耳球虫单独免疫好,与柔嫩艾美耳球虫单独免疫相比无明显差异。结果表明巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫对毒害艾美耳球虫的免疫均具有一定的协同效应;毒害艾美耳球虫对巨型艾美耳球虫的免疫有一定负面影响,而对柔嫩艾美耳球虫的免疫无影响。

“复方常青”对鸡柔嫩艾美耳球虫感染的疗效

为探究基于网状Meta分析配制出的中药组方“复方常青”对鸡柔嫩艾美耳球虫病的治疗效果,将180只黄羽肉鸡随机分为6组,分别为复方常青高、中、低剂量组(A、B、C),地克珠利组(D),不攻虫也不给药的阴性对照组(E)和攻虫不给药的阳性对照组(F)。除E组外,雏鸡在15日龄灌服1×10^(5)个球虫孢子化卵囊以构建感染模型;A、B、C组以中药原药兑水给药,给药浓度分别为5、2.5、1 mL/L,D组以地克珠利溶液1 mL/L兑水给药,并从18日龄起连续治疗5 d。通过增重情况、料肉比、盲肠病变、每克盲肠内容物卵囊数、存活率、抗球虫指数及细胞因子稳态来评价药物治疗效果。结果显示,A组对感染雏鸡增加体重、减轻盲肠病变、减少每克盲肠内容物卵囊数及提高存活率的作用优于其他治疗组,所获得的抗球虫指数最高(>180);B组对细胞因子IL-17、IL-10平衡作用优于其他治疗组。表明复方常青中药组方可有效的治疗鸡柔嫩艾美耳球虫病。

随机扩增多态性DNA技术对鸡的3种艾美耳球虫的鉴别

应用随机扩增多态性 DNA技术 (RAPD)对寄生于鸡的 3种艾美耳球虫 :布氏艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫的基因组 DNA进行分析 ,发现大多数引物对不同种球虫的 DNA扩增产物的电泳带存在明显差异 ,证明

柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtCHP35特性和功能初步研究

鸡球虫病是由几种艾美耳属寄生虫寄生引起的一种家禽肠道疾病。目前,对于该病控制仍然主要依赖于抗球虫药物,但长期广泛地使用药物造成了球虫耐药性的产生。为研究球虫耐药性产生的分子机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因,发现柔嫩艾美耳球虫保守蛋白35(EtCHP35)在盐霉素耐药株和马杜拉霉素耐药株mRNA转录水平显著上调。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板,成功克隆了柔嫩艾美耳球虫保守蛋白35(EtCHP35)基因,并在原核表达系统中成功表达了重组蛋白(rEtCHP3)。利用实时荧光定量PCR分析了该基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段以及不同虫株(敏感株和耐药株)的mRNA转录水平,结果显示EtCHP35基因在敏感株孢子化卵囊的mRNA转录水平最高;与敏感株相比,EtCHP35的mRNA转录水平在马杜拉霉素耐药株和盐霉素耐药株上调,但在地克珠利耐药株mRNA转录水平无差异,且随着盐霉素耐药株浓度的升高,EtCHP35的mRNA转录水平也升高。间接免疫荧光定位结果表明该蛋白主要分布在子孢子和第二代裂殖子的表面和顶部。因此,推测该蛋白可能参与了虫体在宿主体内的生长发育、对宿主细胞的识别附着、逃避宿主免疫应答以及球虫对离子载体类药耐药性产生的过程。

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白Et RON2 L1-2特性与功能初步分析

为研究柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(RON2)同源分子——Et RON2 L1-2的分子特性与功能,利用实时荧光定量PCR、Western blot、入侵抑制试验、间接免疫荧光试验以及双分子荧光互补实验(BiFC)等方法分析其生物学特征。结果发现Et RON2 L1-2蛋白序列与Et RON2仅有29.69%的同源性,转录水平和蛋白水平均在第二代裂殖子阶段最高。抗r Et RON2 L1-2抗体对子孢子入侵细胞有明显抑制作用。Et RON2 L1-2蛋白主要分布于经PBS孵育子孢子的胞质和表面,并分布于经完全培养基孵育或入侵DF-1细胞后2 h子孢子的顶端;其表达量在滋养体和未成熟裂殖体增加,且在带虫空泡膜也有分布;在第二代裂殖子中主要分布于整个胞质。Et RON2 L1-2与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原4(AMA4)之间存在互作关系。

柔嫩艾美耳球虫微管蛋白β链基因EtTBC的克隆、表达及特性的初步分析

鸡球虫病是一种由艾美耳属原生动物寄生虫引起的肠道疾病,是影响家禽业的最重要疾病之一。目前,球虫病的控制主要依赖于抗球虫药物的使用,但由于药物的长期广泛使用导致了球虫的严重耐药性。为研究其耐药性机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株、盐霉素耐药株进行了转录组测序分析,发现与敏感株相比,柔嫩艾美耳球虫微管蛋白β链(Et TBC)仅在地克珠利耐药株高表达。本研究在此基础上,克隆、表达了EtTBC,并初步分析了其功能及与地克珠利的关系;以柔嫩艾美耳球虫敏感株cDNA为模板成功克隆了EtTBC基因,构建了原核表达重组质粒pET28a-Et TBC,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TBC;利用qPCR对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段以及不同虫株(耐药株、敏感株和田间耐药株)的mRNA转录水平进行了分析,结果显示,该基因的转录水平在敏感株未孢子化卵囊阶段最高,且其mRNA转录水平仅在地克珠利耐药株上调;间接免疫荧光定位结果表明该蛋白主要分布在子孢子除折光体外的细胞质和表面,第二代裂殖子的细胞质和表面。

柔嫩艾美耳球虫子孢子感染对CEK细胞免疫因子表达及抗氧化能力的影响

为了探究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)子孢子感染对鸡胚肾(CEK)细胞免疫反应及抗氧化程度的影响,试验在成功构建E.tenella感染CEK细胞模型的基础上,将CEK细胞分为空白组和感染组,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR方法分别检测子孢子感染后第3,9,12,24小时时细胞上清液中与E.tenella感染相关的4种免疫因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度及其在CEK细胞中mRNA相对表达量,同时检测细胞上清液中4种氧化指标过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)浓度。结果表明:子孢子感染后第3,9小时时,感染组IL-6、IL-8及IL-1βmRNA相对表达量及其浓度均极显著高于空白组(P<0.01),且随着感染时间的延长呈下降趋势;感染后第12,24小时时,感染组TNF-αmRNA相对表达量和其浓度均极显著高于空白组(P<0.01),且在感染子孢子后呈上升趋势。此外,感染组CAT和SOD活性在子孢子感染后第3,9,12小时时极显著低于空白组(P<0.01),并呈下降趋势;在感染后第3,9小时时,感染组NO和ROS浓度显著或极显著高于空白组(P<0.05或P<0.01),这些氧化指标的变化主要发生在感染后的9 h或12 h内。说明E.tenella的感染会显著影响CEK细胞的氧化动态平衡与免疫细胞因子的表达水平。

艾美耳球虫的遗传操作:平台建立、应用与展望

艾美耳属球虫是畜牧生产中最常见的寄生虫,引起鸡、兔、羊、牛等养殖动物严重消化系统疾病,影响动物健康和养殖效益。随着分子生物学技术的飞速发展,研究者们先后建立了艾美耳球虫的瞬时转染、稳定筛选和基因编辑等遗传操作平台,实现了艾美耳球虫的基因过表达、基因敲除和基因编辑等操作,极大推进了艾美耳球虫基础生物学和作为新型真核载体疫苗的研究进展,但仍面临一些挑战。本文围绕艾美耳球虫遗传操作平台建立的关键技术、创新性设计、存在的技术瓶颈以及应用前景进行系统梳理和总结,为其他畜禽寄生虫遗传操作平台的构建提供参考,也为球虫病新型防控制剂的研制提供新的思路。