不同环境和营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌生长、产孢及几丁质酶表达的影响

[目的]研究温度、pH和不同营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌(Arthrobotrys conoides)生长及产孢特性的影响,分析其在碳氮饥饿条件下几丁质酶的表达水平,优化该菌的培养条件,为该菌的扩大培养提供参考依据。[方法]将圆锥节丛孢菌AC-shz1菌株接种于YPSSA培养基,分别置于不同温度(15、20、25、30和35℃)、pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)、碳源(果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维素、几丁质)、氮源(甘氨酸、苯丙氨酸、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、尿素)和碳氮比(1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)环境条件下进行培养,观察并记录菌丝的生长速度及形态,测定其产孢能力;在碳氮源饥饿条件下,采用实时荧光定量PCR方法对4种几丁质酶基因的表达水平进行分析。[结果]圆锥节丛孢菌在温度15~30℃均能生长,其中以25℃时菌丝生长最快且产孢能力最强;在pH为6.5~7.5时菌丝生长良好,其中以pH 7.0时产孢能力最强。圆锥节丛孢菌最适菌丝生长和产孢碳源为葡萄糖和蔗糖,其中含葡萄糖的培养基产孢量最高;最适氮源为酵母粉和蛋白胨,含酵母粉的培养基产孢量最高,以葡萄糖和酵母粉为碳氮源的最适碳氮比为5∶1。与对照组相比,在碳饥饿条件下,捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-14(AC-14,P<0.01)和捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-190(AC-190,P>0.05)基因转录水平上调,捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-379(AC-379,P>0.05)和捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-483(AC-483,P<0.01)基因转录水平下调;在氮饥饿条件下,上述4种几丁质酶基因转录水平均极显著下调(P<0.01)。[结论]菌丝生长和产孢最适温度为25℃,最适pH为7.0,最适碳氮源分别为葡萄糖和酵母粉,最适碳氮比为5∶1。本研究结果为进一步研发具有高效的捕食线虫真菌生物防控制剂奠定了基础。

我国分离到的节丛孢属菌

节丛孢属(Arthrobotrys)是捕食线虫真菌中最大的一个属.国内外己报道的有效种约50余种,我国约分离到20余种.本文对我国分离到的节丛孢菌做综合描述.

新疆乌鲁木齐地区捕食性真菌圆锥节丛孢菌的分离鉴定

为了给动物线虫病的防治工作提供适应本地生存的候选捕食性真菌菌株,对新疆乌鲁木齐地区采集的土壤进行筛选,采用土壤撒布法,以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)作为诱饵线虫对土壤中的捕食性真菌进行分离鉴定,成功分离出具有捕食线虫功能的真菌1株。通过形态学观察,该菌捕食器官为黏性菌网,分生孢子无色,呈圆锥形,中央有一分隔,形态结构与节丛孢属相符。分子生物学分析显示,该分离株的ITS2基因序列与圆锥节丛孢菌(Arthrobotrys conoides)的同源性为99%~100%,判定该菌为圆锥节丛孢菌的新疆分离株。在实验室条件下,利用该菌株进行捕食线虫活力测定,结果发现该菌株在CMA培养基中对马圆形线虫三期幼虫的捕食率为97.47%,具有较强的捕食效率,可作为新疆地区动物线虫病生物防治工作的候选菌株。

嗜线虫节丛孢(Arthrobotrys flagrans)用于生物防治动物寄生线虫的研究进展

捕食线虫性真菌Arthrobotrys flagrans首次由Duddington于1948年从腐烂的蔬菜里发现[1],并将该菌命名为Trichothecium flagrans。Cooke于1969年重新定义后为该种建立了一个新属(Duddingtonia属)[2],称为Duddingtonia flagrans,是该属唯一的种。Scholler等于1999年通过分析捕食线虫性真菌的18S r DNA和内部转录间隔区(ITS)的基因序列,认为捕食线虫性真菌的捕食器官类型在其属的分类上有重要意义。

口服少孢节丛孢菌孢子对家畜粪便中线虫幼虫的杀灭研究

对捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)菌株进行了临床杀家畜寄生性线虫幼虫作用的研究。结果表明:培养的少孢节丛孢菌分生孢子经口饲喂动物后,对粪便中线虫幼虫的杀虫率分别可达96.3%(羊)、96.5%(牛)和97.4%(马)。说明少孢节丛孢菌菌株分生孢子可通过家畜消化道,并保持了其捕食寄生性线虫的能力。研究结果为捕食线虫性真菌的临床应用奠定了重要基础。

捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌体外杀寄生性线虫幼虫的研究

对捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌(Arthrobotrysoligospora)菌株体外粪便捕杀马寄生性线虫幼虫进行了研究。结果表明:菌株可以在体外粪便中发育并发挥其捕食作用。在实验室条件下,其对寄生性线虫第一、二期幼虫的作用与对第三期幼虫的作用相比较,捕获致死速度快。菌株对马粪便中线虫幼虫的杀虫率高达98.7%;与对照组相比有显著差异。而且加入粪便的分生孢子数量在达到一定阈值后,再加入分生孢子,则杀虫率不再增加。此结论对捕食线虫性真菌今后临床的应用具有实际指导意义。

少孢节丛孢菌的分离鉴定及捕食线虫活性研究

为研究新疆地区捕食线虫性真菌的生物活性,本实验采用玉米粉琼脂培养基(CMA)培养分离自新疆不同地区的捕食线虫性真菌,通过对分离株纯培养物的形态学观察和18S rDNA基因序列分析,鉴定4株少孢节丛孢菌,分别命名为XA3、XA6、XD1和XD4。18S rDNA基因遗传进化分析表明,XA3、XA6、XD1和XD4新疆分离株之间同源性较高,与GenBank登录的少孢节丛孢菌CBS289.82株同源性最高,分别为99.6%、99.5%、99.1%和98.9%,与形态学鉴定结果一致。捕食线虫活性测定试验表明,4个分离株在CMA中的捕食率为92.8%～97.6%;体外对绵羊粪便中线虫幼虫的捕食率为90.7%～95.4%,均具有很强的捕食活性。本研究为研究绵羊消化道线虫生物防控制剂奠定基础。

节丛孢属丝孢菌对松材线虫和拟松材线虫的捕食

利用节丛孢属捕食线虫真菌的 8个种 ,1 1个菌株 ,对松材线虫 (Bx)和拟松材线虫(Bm)进行了捕食力的测定。结果显示节丛孢属真菌对这两种线虫的捕食能力既存在种间差异 ,也存在同种不同菌株间的差异。指状节丛孢的 3个菌株Ad 1 ,Ad 2 ,Ad 3菌株对两种线虫均表现出较高的捕食率 ,接种 7d后对Bx和Bm的捕食率分别达到了 98 0 8%,91 1 6 %,86 3 %和 96 2 8%,90 45 %,85 3 8%;同一菌株对松材线虫和拟松材线虫的捕食没有选择性。此外 ,通过对松材线虫和拟松材线虫繁殖真菌的筛选实验 ,肯定了利用拟松材线虫代替松材线虫进行生防菌株筛选的可行性。

节丛孢属食线虫真菌对体外奥斯特线虫幼虫的捕食效果

本文在国内首次报道了几株节丛孢菌食线虫真菌（５株寡节丛孢菌和２株葡萄串状节丛孢菌）在体外对山羊奥斯特线虫第３期幼虫的捕食效果。结果表明：７株真菌对奥斯特线虫幼虫的捕获率分别在７５．０％～９６．４％之间，具有较高的捕杀线虫能力。食线虫真菌对线虫的作用方式主要是通过在线虫周围形成菌网。

捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌理化特性研究

研究了捕食线虫性真菌—少孢节丛孢菌 (Arthrobotrysoligospora)的染色特性、分生孢子对外界理化因素的抵抗力以及菌丝对线虫第三期幼虫的吸引作用等。结果表明少孢节丛孢菌用革兰氏、瑞氏、姬姆萨氏液染色都能很好的着色 ;分生孢子对高温敏感 ,对抗生素不敏感 ,高浓度的氢离子或氢氧根离子能杀死分生孢子 :但分生孢子耐低温 ,因此可用低温冷冻法保存捕食线虫性真菌分生孢子 ,其方法简便易行。首次解决了国内外在捕食线虫性真菌菌种保存中的难题。研究显示菌丝对线虫第三期幼虫无明显吸引力。

不同碳氮源及其比例和培养基初始pH值对少孢节丛孢菌菌丝生长的影响

为研究不同碳源、氮源、碳氮比值及培养基初始pH值对少孢节丛孢菌菌丝生长的影响,采用10种碳源和8种氮源物质进行了试验,结果表明:在固体培养基上,少孢节丛孢菌菌丝生长的最适碳源和氮源分别是蔗糖和蛋白胨;在液体培养基内,最适碳源和氮源分别是红薯滤液和硫酸铵。当固体培养基中碳氮比为5∶1、液体培养基中碳氮比为10∶1时,菌丝生长最快。在初始pH值为3.7时,液体和固体培养基中的菌丝均不能生长;固体培养基中最适合的初始pH值范围是7.0～8.0,以pH值为7.5时菌丝的生长率最大;液体培养基中最适合的初始pH值范围是5.0～7.0,以pH值为7.0时菌丝生长最佳。说明不同的碳源、氮源、碳氮比及培养基初始pH值对少孢节丛孢菌菌丝生长率的影响是不同的,而且固体培养基和液体培养基中最适碳氮源、碳氮比、初始pH值也存在差异。

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。

少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶基因的克隆及生物信息学分析

为研究捕食线虫性真菌几丁质酶的功能,在国内首次对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-801和AO-483基因进行扩增、克隆及测序,并对其编码蛋白信号肽、疏水性与亲水性、高级结构、功能域进行预测和分析。结果显示,2个不同蛋白均具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,无信号肽序列,表明这2个蛋白为非分泌型蛋白,二级结构以无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构。系统发育分析表明,几丁质酶AO-801和AO-483与昆虫病原真菌几丁质酶的亲缘关系更为接近,说明它们所产生的几丁质酶在侵染宿主的过程中发挥着类似的功能,并且不同来源真菌几丁质酶根据分子质量的差异形成3个不同的进化分枝。

温度和pH值对节丛孢属食线虫真菌生长的影响观察

对ｐ Ｈ 值和温 度对节丛 孢属食线 虫真 菌生 长的 影 响进 行了 观 测。结 果 表明， 节丛 孢 属食线虫真 菌在ｐ Ｈ５０ ～８ ０ 之 间均 能够 生长， 但 ｐ Ｈ６０ ～６５ 时，生 长最 佳； 真菌 在１０ ～３０ ℃ 时 均能生长，５ ℃和３５ ℃时则 基本上 停止生长 。真菌在 ２０ ～２５ ℃时，生 长最佳 。

少孢节丛孢菌粗蛋白和氨基酸含量的测定

采用常规的粗蛋白和氨基酸分析方法,分别测定了含捕食器菌丝(含有普通营养菌丝、菌环和菌网)、普通营养菌丝、分生孢子、线虫三期幼虫的粗蛋白和氨基酸含量。结果显示,粗蛋白含量在含捕食器菌丝、普通营养菌丝、分生孢子和三期幼虫中分别为43.08%、33.65%、39.30%和65.91%。氨基酸的总量分别为31.859mg/100mg、20.584mg/100mg、32.111mg/100mg和44.077mg/100mg。上述样品中,均未测出色氨酸的含量。结果表明,少孢节丛孢菌捕食器的粗蛋白高于普通营养菌丝或分生孢子的粗蛋白含量,而线虫三期幼虫的粗蛋白含量最高。并且在含捕食器菌丝和线虫三期幼虫中,缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸以及酪氨酸的含量都比普通营养菌丝及分生孢子中的含量高,而前3种氨基酸据认为与捕食性真菌产生捕食器有关。

节丛孢属真菌抗反刍动物消化菌株的体外筛选

利用食线虫真菌对动物寄生线虫病进行生物防治是寄生虫学当今的研究热点之一。获得能够通过动物消化道的食线虫菌株是取得成功的前提。本文采用模拟反刍动物瘤胃和真胃的消化道作用，对８４株节丛孢属的食线虫真菌进行了体外抗消化筛选。结果表明：共有２３株通过了２４ｈ瘤胃液的处理，通过率为２７．３８％；１６株同时还通过了４ｈ盐酸－胃蛋白酶的处理，通过率为１９０４％。

捕食线虫性真菌—少孢节丛孢菌口服生物制剂安全性试验

为研究少孢节丛孢菌口服生物制剂的安全性,将20只6月龄绵羊分成4组,前3组分别灌服含有1.0×105、1.0×106、1.0×107少孢节丛孢菌分生孢子口服生物制剂,第4组为对照组灌服灭菌的生理盐水,灌服后连续30d观察绵羊的各项临床指标;并在7d后每组分别剖检2只绵羊,无菌采集绵羊各器官组织,进行组织切片和少孢节丛孢菌的分离鉴定;另外,将12只感染捻转血矛线虫后的绵羊分成3组,灌服3个不同剂量的生物制剂后测定其对粪便中线虫的捕食活性。结果表明,绵羊的精神状态、食欲、饮水、体温、粪便、增量正常;绵羊肝脏、脾脏、肾脏、肠道淋巴结等组织器官没有出现病理变化;也未从上述组织中分离出少孢节丛孢菌;3个不同剂量的生物制剂均可显著降低绵羊粪便中的幼虫数量。研究结果证实,少孢节丛孢菌口服生物制剂安全有效,无毒副作用。

少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物在捕食线虫过程中的作用研究

为了解捕食性真菌——少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物的性质及在捕食线虫过程中的作用,作者首先用氨基酸诱导产生大量捕食器(菌环和菌网)菌丝,然后分别应用5种不同化学性质的溶液、2种酶和7种蛋白酶抑制剂处理捕食器表面聚合物,观察对捕食和致死线虫作用的影响,同时使用上述物质或溶液处理菌丝以确定对菌丝生长的影响。结果表明:5 mol.L-1LiCl溶液和链霉蛋白酶E可明显降低真菌的捕获线虫的能力;0.1 mol.L-1NaOH、SDS-巯基乙醇-尿素PBS溶液、1.5%(w/v)SDS除可抑制捕获虫体外,同时还抑制了真菌菌丝的生长;除菲啰啉外,其余6种酶抑制剂对真菌的黏附捕获作用无明显影响;但其中丝氨酸蛋白酶类抑制剂还可抑制真菌对线虫的致死作用;另外用酶抑制剂处理线虫后,对真菌的黏附捕获作用也无明显影响。上述结果表明少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物在黏附捕获线虫过程中起关键作用,其为蛋白质或含蛋白质类物质;并间接证实黏附捕获阶段不需要蛋白酶参与,但其在致死线虫阶段会发挥重要作用。这为阐明捕食性真菌作用机理提供了非常有价值的资料。

少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)表面聚合物的提取及生化性质研究

为了解捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)捕食器表面聚合物的生化性质与作用,用5mol·L-1LiCl的表面聚合物提取液提取位于捕食器表面的这类物质,进而测定其中蛋白质的含量与酶的活性,并详细研究了温度、pH、化学试剂和蛋白酶抑制剂对其性质的影响。结果表明:2种不同来源的表面聚合物[表面聚合物(T+)与表面聚合物(T-)]最适温度均为65℃,前者最适pH为7.0,后者最适pH范围为6.5～7.5,且前者大相对分子质量蛋白质的浓度相对后者要高;同时还首次在含捕食器菌丝提取到的表面聚合物中检测到了蛋白酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性。通过研究初步了解了存在于捕食器表面并参与捕食过程的蛋白质类物质的相关化学性质,间接证实了上述物质可能在捕食过程中起关键作用,为今后深入开展对捕食线虫性真菌作用机理方面的研究提供了非常有价值的资料。

少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因同源性分析

为了比较不同地理株的捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因的同源性,首先利用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒,提取少孢节丛孢菌内蒙古株(Arthrobotrys oligospora CHIM)的DNA,然后根据GenBank中相应丝氨酸蛋白酶基因,分别设计上下游引物;再经PCR扩增后,纯化并回收扩增产物,然后进行序列测定并分析。结果表明:少孢节丛孢菌内蒙古株丝氨酸蛋白酶基因序列与少孢节丛孢菌瑞典株(AY444597)和少孢节丛孢菌云南株(AF516146)同源性分别为80.3%和84.1%;虽然这3株菌具有较高的亲缘性,但其差异也非常明显,这一结果说明少孢节丛孢菌在不同国家或地区间有差异。