芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

从杭州郊区感病的甘蓝型油菜上分离到一种致病力较强的芜菁花叶病毒（Ｔｕｒｎｉｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴｕＭＶ）分离物。大量提取病毒并纯化后，电镜观察病毒粒子约７４０ｎｍ×１２ｎｍ。以寡聚（ｄＴ）１５为引物合成ｃＤＮＡ，并根据外壳蛋白（ＣＰ）基因两端序列设计两个诱变引物进行ＰＣＲ扩增，得到一个特异性ＤＮＡ片段。将该片段克隆到ｐＵＣ１８中，经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法测序，结果表明该ＣＰ基因全长为８６７ｂｐ。与前人报道的两种芜青花叶病毒ＣＰ基因的核苷酸序列的同源性分别为８９．５％和９６．７％。，氨基酸序列的同源性分别为９４．５％和９７．９％。将ＣＰ基因亚克隆到原核表达载体ｐＫＫ２３３－２中，用ＩＰＴＧ诱导含插入片段表达载体的大肠杆菌，Ｗｅｓｔｅｍ印迹检测证明，大肠杆菌能表达病毒的ＣＰ。

不同寄主植物上芜菁花叶病毒外壳蛋白基因克隆及分析

为研究芜菁花叶病毒在不同寄主植物上的变异,从江苏省徐州市感病的油菜、萝卜及菠菜上分离到3个芜菁花叶病毒分离物,分别命名为XZYC、XZLB、XZBOC.经单斑分离,利用RT-PCR克隆了这3个分离物的cp基因序列,并进行了序列分析.结果表明,3个分离物的cp基因大小均为867 bp,一致率较高,为99.8％ ～ 99.9％,氨基酸一致率为100.0％.所分析的分离物cp基因未发现明显重组.山东分离物之间、江苏分离物之间及江苏和山东分离物之间基因交流频繁,两地区遗传分化显著.将中国和日本的部分分离物构建系统进化树,分为4个组,日本和中国分离物Basal-BR组分离物单独成簇,本研究的3个分离物都位于Basal-BR组.

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析

将来自北京地区甘蓝和芥菜上的TuMV外壳蛋白基因片段分别克隆到pMD18-T载体中，测序并进行序列分析。结果表明：两者CP基因序列长度均为867个核苷酸，编码288个氨基酸，它们的核苷酸同源性为97．2％，氨基酸同源性为97．6％；两者与GenBank中的部分CP基因序列的核苷酸同源性在87．8％～97．8％之间，氨基酸同源性在91．7％～99．0％之间；分子进化树分析两者可归属World-B组。

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

本文报道采用反转录酶—聚合酶链式反应，体外扩增芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）外壳蛋白基因及其克隆，并在大肠杆菌中获得表达的结果；从抗州市郊区感病的油菜上分离到一株致病力极强的芜菁花叶病毒分离物，提纯后，经５０ｎｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ和０．５％ＳＤＳ处理，苯酚／氯仿和氯仿抽提两次，酒精沉淀，获得了纯化的病毒ＲＮＡ，该ＲＮＡ与ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）＿（１５）退火后，在ＡＭＶ反转录酶的作用下合成了单链ｃＤＮＡ，然后加入用以扩增ＴｕＭＶ－ＣＰ基因的上下游引物，３５个循环后，得到了一条长约０．８５ｋｂ的片段，将该片段克隆到ｐＵＣ１８质粒的ＳａｌⅠ限制性酶切位点，分析了限制性酶切图谱，分析表明该片段含有ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ以及引物设计时带人的ＭｃｏⅠ三个酶切位点，该片段克隆到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）原核表达载体ｐＫＫ２３３－２质粒的ＮｃｏⅠ和ＨｉｎｄⅡ位点后，经ＩＰＴＧ诱导，以该病毒的抗血清为第一抗体，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测该基因的表达产物，结果表明该基因的表达产物为ＴｕＭＶ－ＣＰ蛋白，因而认为所获得的扩增片段确为芜菁花叶病毒外壳蛋白基因。

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据芜菁花叶病毒（TurnipMosaicVirus，TuMV）外壳蛋白（CP）基因序列人工合成引物，用RT法合成cDNA后，通过PCR法扩增并克隆TuMV海南分离物外壳蛋白基因。结果表明，外壳蛋白基因全长864个碱基，编码288个氨基酸。与Trembly，M．F等报道的核苷酸同源率为95．8％，氨基酸同源率为94．8％。与徐平报道的核苷酸同源率为96．3％，氨基酸同源率为95．1％。与孔令洁报道的核苷酸同源率为88％，氨基酸同源率为90．6％。将CP基因插入pET－21b多克隆位点，转入E．colt后诱导表达，聚丙烯酸胺凝胶电泳分析呈现一特异的蛋白带，Westernblot检测证明，该特异带与TuMV抗血清呈阳性反应。

苹果坏死花叶病毒CP基因原核表达及其抗血清制备

苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规检测方法尤为必要.通过设计特异性引物,以RT-PCR方法成功获得ApNMV CP基因序列,插入到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG进行重组蛋白(含His-tag)诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,用Ni Sepharose 6 Fast Flow进行蛋白纯化,回收共得到重组蛋白2.4 mg.在屏障环境下免疫2只SPF级新西兰兔,制备出多克隆抗血清,稀释400倍后仍能与ApNMV阳性苹果叶片样品发生免疫反应.由此证明,本研究建立的ApNMV间接ELISA检测方法具有较好的灵敏性,检测效率高,能够用于田间大量样品ApNMV的诊断.

芜菁花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

从山东省 3 地市感病的白菜和萝卜上分离到芜菁花叶病毒 6 个分离物,将其分别命名为 TuMV-SD1、TuMV-SD2、TuMV-SD3 、TuMV-SD4、 TuMV-SD5 和 TuMV-SD6。利用 RT-PCR 克隆了这 6 个分离物的外壳蛋白基因,测定了它们的核苷酸序列,并进行了序列分析。结果表明,6 个分离物的 CP 基因均为 867 个碱基,核苷酸序列同源性较高, 达 97.0%～99.4%;它们与 World-B 组分离物的同源性最高,达 91.8%～100%;与 Brassica- Raphanus (BR) 致病型分离物的同源性次之,在 89.1%～91.0%之间;与 basal-B 组分离物的同源性最低,仅 86.0%～90.3%。基于 TuMV 的 CP 基因核苷酸序列的分子进化树显示,TuMV 分离物可分为 4 组,本研究所分离到的 6 个 TuMV 山东分离物属于第四组,即 world-B 组。用分离到的 6 个 TuMV 分离物对已获得的转 TuMV CP 基因的抗病毒大白菜进行攻毒试验。结果表明,尽管作为转基因的 CP 基因与这 6 个分离物的 CP 基因只有 88.2%～88.9%的同源性,但转基因大白菜对这 6 个分离物均具有明显抗性。

侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及RT-PCR扩增外壳蛋白基因研究

从杭州市郊区及本校附近菜园地表现严重花叶症状的花椰菜上分离到一种线状病毒，接种６科３１种鉴别寄主，能侵染５科２２种植物。病组织超薄切片可见风轮状内含体和片层聚集状内含体。感病的芥菜叶片，用０．５ｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液（ｐＨ７．５）匀浆后汁液加４％ＰＥＧ－８０００沉淀３ｈ，５％～４０％甘油梯度离心纯化病毒，可获得较高的产量。提纯的病毒均为一弯曲的线状颗粒，长度７４０ｎｍ左右。病毒提纯液于２６４ｎｍ处有一吸收峰，为典型的核蛋白紫外吸收。ＴｕＭＶ－Ｈ分离株抗血清包被的铜网能大量吸附病毒颗粒。用特异的ＰＣＲ引物扩增其外壳蛋白基因，可得－０．９Ｋｂ的片段。

芜菁花叶病毒杭州分离株外壳蛋白基因序列分析

从杭州郊区分离出一个ＴｕＭＶ强毒株系，利用分子克隆和Ｓａｎｇｅｒ双脱氢测序方法分析了其外壳蛋白基因的ＤＮＡ序列．该序列与已报道的其他４种ＴｕＭＶ分离物都具有较高的同源性，最高达９７．６％，最低达８９．５％，其氨基酸序列的同源性更高，最高达９７．９％，最低达９４．５％。本文分析了该序列中ＡＴ和ＧＣ含量，计算了４种核苷酸在有意义链中和在密码子不同位置上的出现频率，同时还分析了该病毒外壳蛋白氨基酸遗传密码的使用频率。

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及其植物表达载体的构建

从感病的萝卜叶片中得到芜菁花叶病毒(TuMV)的分离物,以oligo(dT)为引物,合成了其基因组RNA的互补DNA,并克隆到载体λ-ZAPⅡ中。通过单链cDNA探针杂交和DNA末端序列分析找出含有poly-A尾巴的阳性克隆。我们对一个含有1429个碱基插入片断的克隆进行了序列分析,根据芜菁花叶病毒外壳蛋白分子量的大小和马铃薯Y病毒组蛋白质加工位点氨基酸序列的保守性,确定了外壳蛋白基因的5′末端。利用PCR方法对其5′末端进行改造,加进起始密码ATG和两个限制性内切酶位点。通过基因重组操作,将该基因插入到双元载体pBI121的衍生物pBIN437中,得到芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体。

黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较

对我国分离的经生物学和血清学鉴定为黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）亚组Ⅰ和Ⅱ的各一分离物（ＧＢ、ＸＢ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因进行了序列分析和比较。以提纯病毒ＲＮＡ为模板，进行逆转录及ＰＣＲ扩增，并通过常规基因克隆方法得到插入ＣＰ基因片段的重组克隆。对插入ＧＢ和ＸＢ两个分离物ＣＰ基因片段的重组克隆进行全序列测定，结果表明重组克隆序列长分别为７７７ｂｐ和７９２ｂｐ，均只含一个开放读框（ＯＲＦ），长度为６５７ｎｔ，可编码２１８个氨基酸；两个分离物的ＣＰ基因核苷酸序列同源率为７７５％，氨基酸序列同源率为８２６％。与我国已报道的７个ＣＭＶ分离物的ＣＰ基因序列比较，分离物ＧＢ的同源率为９１３％～９７３％，分离物ＸＢ的同源率为７６６％～７８４％。与国际上已报道部分ＣＭＶ株系的ＣＰ基因序列相比较，分离物ＧＢ与亚组Ⅰ株系有更密切的亲缘关系，而分离物ＸＢ则与亚组Ⅱ株系的亲缘关系更密切。

土传花叶病毒外壳蛋白基因导入小麦的研究

利用基因枪技术 ,将小麦土传花叶病毒外壳蛋白基因CWMV CP1和筛选基因bar导入扬麦 15 8,获得14 5株抗Bialaphos再生植株 ;PCR Southern分析 ,其中 2 1株为阳性植株 ,转化率达到 0 .99% ;T1代植株的PCR Southern、单酶切和双酶切Southern杂交 ,证明外源抗性基因已经完整地整合到小麦基因组中 ;T1代植株分离比CP1+ ∶CP1-为 1∶1.3,偏离孟德尔分离定律 ;T2 代植株总RNA ,RT PCR的试验结果表明CWMV

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及在病毒检测中的应用

根据已经发表的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白基因的序列,人工合成引物,通过反转录和PCR扩增并克隆了黄瓜花叶病毒辣椒分离物P33(CMV-P33)的外壳蛋白基因,构建到质粒PBS的Hinc位点.重组质粒经Sma酶切后,在0.8%低熔点琼脂糖上电泳,回收克隆的CP基因片段(约0.7kb),用切口平移的方法进行α-32PdATP标记.以此为探针,通过点杂交技术检测提纯的病毒CMV-P33和R1株系、CMV-P33的RNA,及受CMV侵染的辣椒叶片汁液,结果表明:提纯的CMV-P33和R1株系的最低检出量分别为1ng和4ng,CMV-P33的RNA为0.1ng.检测受CMV侵染的辣椒叶片汁液时,最大稀释倍数为100倍.其次,用该探针检测健康辣椒和受烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯Y病毒侵染的烟叶汁液时,检测反应均为阴性.

利用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因导入玉米优良自交系

利用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因导入玉米优良自交系18-599红、18-599白幼胚诱导的愈伤组织,转化的愈伤组织在Bialaphos浓度为8mg/L、10mgL、5mg/L的筛选压下经过三次抗性筛选后,分别再生出可育植株12株和6株。PCR检测结果表明18-599红和18-599白分别有10株和3株为阳性,说明CP基因已导入到玉米自交系中。

云南烟草花叶病毒外壳蛋白基因的分离克隆及序列分析

从云南弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝植斑分离，经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ；在烤烟品种红花大金元上以ＴＭＶ普通株作对照进行致病率测定，确定为强毒株系。以烟草花叶病毒（ＴＭＶ）云南强毒株系ＲＮＡ为模板，根据国外研究结果，自行设计、合成寡核苷酸为引物，通过ＰＴ－ＰＣＲ体外扩增，得到约５００ｂｐ的ＤＮＡ片段，将其克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α上，并进行了序列分析。分析表明，该其因含４７７个核苷酸，编码１５９个氨基酸，与国外发表的Ｕ１株系比较，核苷酸同源率为９８．１％，氨基酸同源率为９７．５％。获得了云南烟草ＴＭＶ外壳蛋白全基因片段。

新疆加工番茄条斑坏死病原黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从表现花叶、畸形以及坏死症状的加工番茄病株上获得黄瓜花叶病毒分离物，用1对CMV CP基因引物进行RT-PCR，扩增得到了776bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物插入到克隆载体PUCm-T中转化大肠杆菌DHSa。经限制酶酶切鉴定，重组克隆中含有与PCR产物大小相同的776bp的插入片段。cDNA全序列分析表明，重组克隆含1个开放阅读框架（ORF），长度为657nt，编码218个氨基酸组成的蛋白。与国内外报道的CMV株系序列比较，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的核苷酸同源性高达91．0％-98．9％．而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在76．4％-78．2％，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的氨基酸同源性高达94．2％-98．6％；而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在79．9％～83．5％．CMV亚组Ⅰ的株系较CMV亚组Ⅱ株系同源关系更密切，所以CMV新疆分离物应该归属于CMV亚组Ⅰ。

香蕉花叶病毒外壳蛋白基因克隆及表达载体的构建

从海南大田感染香蕉花叶病的香蕉叶片 ,获得香蕉花叶病毒 ,提纯其 RNA,在 AMV反转录酶作用下合成 c DNA第一链 ,经 PCR扩增 ,获得一约 70 0 bp的 DNA片段 ,测序结果显示所克隆的 DNA片段包含一完整的香蕉花叶病毒株系 ( CMV-BHI)外壳蛋白基因 ,长度为 6 5 7bp,然后将此 DNA片段 ,分别克隆到p BI1 2 1和 p KHG4质粒 ,构成两个含 Ca MV35 s启动子 ( 5 '-端 )、NOS终止子 ( 3'-端 )和分别含 NPT 标记基因和 NPT 及 HPT标记基因的植物表达载体 ( p TBB和 p TBK)。然后用 p AHC1 8中的 UBI promoter换下p BI1 2 1的 Ca MV35 s promoter,构成 p BIAH;再用 CMV-BHI外壳蛋白基因换下 p BIAH中 GUS基因 ,构成一含单子叶植物启动子 UBI和 NPT 标记基因的植物表达载体 ( p TBBU)。从而为

芜菁花叶病毒外壳蛋白在寄主植物叶绿体中的积累及其对光系统II活性的影响

分别以接种感染芜菁花叶病毒(TuMV)和健康对照的青菜苏州青品种(Brassica chinensis L. cv.Suzhou)和芥菜温州芥菜品种(B.juncea L. cv.Wenzhou)叶片为材料提取完整叶绿体,用胰蛋白酶消除其表面蛋白后,抽提总蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western blot检测,发现TuMV的外壳蛋白(CP)存在于感病寄主的叶绿体中。免疫金标记电镜实验显示TuMV-CP定位在感病青菜和芥菜的细胞质和叶绿体中。对两种寄主植物叶片的叶绿素荧光动力学参数测定结果显示,青菜、芥菜的Fv/Fo、Fv/Fm、φPSII、qp值都有不同程度的降低,qN值增大。实验结果表明TuMV侵染后在寄主细胞叶绿体中积累的CP,抑制了光系统II(PS II)的光化学活性,这可能是影响寄主植物光合作用的一个重要原因。