耐热古菌芝田硫化叶菌海藻糖生成相关酶的基因克隆、表达和序列分析

从耐热古菌海藻糖芝田硫化叶菌B12中分别克隆出海藻糖生成相关酶———麦芽寡糖基海藻糖合酶的基因treY和麦芽寡糖基海藻糖基水解酶的基因treZ,测定了其核苷酸序列并进行了表达.其中treY编码的蛋白质有 72 8个氨基酸、分子质量为 86ku;treZ编码的蛋白质有 5 5 9个氨基酸、分子质量为 6 5ku.它们与已报道的其他微生物的两个海藻糖生成相关酶的基因进行同源性比较,treY和treZ的同源性分别为 93%和 76 % (硫矿硫化叶菌P2)、97%和 95 % (硫矿硫化叶菌KM1)、6 3%和 6 6 % (嗜酸热硫化叶菌ATCC3390 9)、4 8%和 5 0 % (节杆菌Q36 )、4 8%和 5 2 %(根瘤菌M11)、5 0 %和 5 2 %(短杆菌).通过PHYLIP软件进行这些基因序列的分类聚类计算,获得这几种微生物间两个酶类的蛋白质系统进化树;经过氨基酸序列比较分析还发现,所有的海藻糖生成相关酶都含有糖苷酶家族 13中几个高度保守的α 淀粉酶催化活性区。

释唐代“芝田”

有人根据新旧《唐书》中著录的《种芝经》和唐诗中的"芝田",认为唐代已有灵芝栽培技术。《种芝经》内容虽已不存,但从性质和年代相近的文献《种芝草法》和《太上灵宝芝草品》来看,文中不认为《种芝经》可以被视作唐代的灵芝栽培专著。而唐诗中的"芝田"一词实际上典出曹植的《洛神赋》,本义为仙人种芝草处,在唐诗中有时指虚渺的仙人种灵芝之田,有时指现实生活中的农家良田,但并无人工栽培灵芝之田的意思。加之唐代发展出的三种栽培大型真菌的技术均与灵芝无关,因此实际上唐代并未发展出人工栽培灵芝的技术。

芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶基因工程菌表达条件的优化

对本室构建的生产海藻糖的基因工程菌株 ,即来自古细菌芝田硫化叶菌B1 2的新型α 淀粉酶基因的工程菌的表达外源蛋白条件进行宿主菌 ,培养基 ,诱导时间 ,诱导温度和诱导菌浓的起始OD60 0 等条件的优化 ,发现在宿主菌为大肠杆菌DH5α ,培养基为改进的LB ,诱导时间 4小时 ,诱导温度 41℃ ,OD60 0 为 0 6～ 0 8时 ,基因工程菌ESBAM中新型α 淀粉酶的表达量最高 ,新型α 淀粉酶活力也最高 ,与重组酶MTSase一起作用底物直链淀粉 ,经HLPC检测在反应产物中有海藻糖的生成。

极端嗜热古菌——芝田硫化叶菌DNA解旋酶的分离纯化和性质研究

采用QSepharose离子交换层析、磷酸纤维素P1 1吸附层析、肝素琼脂糖吸附层析、Su perdex 2 0 0凝胶过滤和PhenylSuperose疏水层析等步骤 ,从嗜酸热芝田硫化叶菌细胞裂解液中分离纯化了一个DNA解旋酶。该解旋酶具有受DNA激活的ATP酶活性。根据SDS PAGE测定结果 ,该酶的分子质量约为 63kD。芝田硫化叶菌DNA解旋酶可以解开底物上 70bp的双链区 ,其解旋活性依赖于双链区旁的单链分叉。该解旋酶的活性依赖于Mg2 + 和ATP的水解 ,在NaCl浓度超过 2 0 0mmol L时受到抑制。该酶的最适pH为 6 7。该酶在 40℃～ 80℃之间均有活性 ,70℃时活性最高。芝田硫化叶菌DNA解旋酶是从古菌中分离得到的第一个天然DNA解旋酶。

极端嗜热古菌——芝田硫化叶菌DNA结合蛋白Ssh12对DNA超螺旋的影响

通过SPSepharose,DNA纤维素和磷酸纤维素等柱层析 ,从极端嗜热古菌———芝田硫化叶菌 (Sulfolobusshibatae)中纯化得到分子量为 11.5ku的DNA结合蛋白Ssh12 .Ssh12约占细胞总蛋白的 4% .该蛋白既能与负超螺旋DNA也能与松弛DNA结合 .利用含单切刻环状DNA进行的切刻闭合分析表明 ,Ssh12在与DNA结合时能够固定负超螺旋 .这种能力在室温 ( 2 2℃ )下很弱 ,而在 3 7℃以上则大大增强 .Ssh12的细胞内含量和固定负超螺旋的能力提示 ,该蛋白对于芝田硫化叶菌染色体DNA的组织以及热稳定性起着重要作用 .

芝田硫化叶菌SSV1病毒DNA复制的诱导

芝田硫化叶菌（Sulfolobus shibatae）是一种极端嗜热古菌,其所携带的温和病毒SSV1是研究古菌DNA复制的一个非常合适的系统.杂交分析表明,静置培养时,芝田硫化叶菌细胞内几乎检测不到游离SSV1 DNA,病毒 DNA主要以整合状态存在.经紫外或丝裂霉素诱导后,细胞内游离SSV1 DNA含量明显增加,但整合SSV1 DNA拷贝数不变.丝裂霉素诱导作用的重复性明显高于紫外诱导.另外,当细胞由静置培养改为摇床培养时,SSV1 DNA也被诱导复制.据此,建立了 SSV1 DNA复制的丝裂霉素诱导方法.采用此法,芝田硫化叶菌细胞内游离 SSV1 DNA含量在诱导后 10h开始明显增加,并在12～15h达到最大值.诱导后细胞内游离病毒 DNA的拷贝数可达到 50.上述诱导方法的建立以及对诱导后SSV1 DNA复制行为的描述为确定 SSV1病毒 DNA的复制原点、分析其复制模式奠定了基础.

芝田硫化叶菌Ssh7蛋白的进化保守性及DNA结合特性

嗜酸热古菌——芝田硫化叶菌（Sulfolobus shibatae）合成大量7kD DNA结合蛋白Ssh7.Southern杂交结果显示,该菌基因组中含有两个编码Ssh7蛋白的基因,分别命名为ssh7a和ssh7b.对这两个基因进行了克隆、序列测定和在大肠杆菌中的表达.测序结果表明,两个Ssh7多肽仅在3个氨基酸位置上有差异;此外,ssh7a和ssh7b的顺式调控序列也十分相似,提示存在着维持两个基因的序列和表达都不变的选择压力.杂交结果还显示,与芝田硫化叶菌一样,硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）基因组中也含有两个编码7 kD蛋白的基因.结合其他报道,这一结果提示编码7kD蛋白的基因可能在硫化叶菌种间分歧形成之前发生了基因复制.采用电泳迁移率改变试验（EMSA）分析了天然及重组Ssh7蛋白与双链DNA片段之间的相互作用.天然和重组蛋白的EMSA行为相似,说明Ssh7与DNA的相互作用既不受发生在天然蛋白赖氨酸残基上的甲基化的影响,也不受两种多肽异构体之间在序列上的差异的影响.在所采用的实验条件下,Ssh7与双链DNA片段结合时的结合位点大约为6.6bp,表观解离常数为（0.7～1.0）×10-4mol/L.此外,Ssh7与负超螺旋DNA的结合强于与线性和松弛DNA的结合.

Ssh10b2与其同源蛋白Ssh10b在细胞含量及固定DNA超螺旋的能力上存在明显差异

极端嗜热古菌———芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)基因组含一对亲缘关系较远的同源基因,ssh10b和ssh10b2。这对同源基因编码的蛋白(Ssh10b和Ssh10b2)属于古菌Sac10b DNA结合蛋白家族。关于Ssh10b以及与其极为相似的硫矿硫化叶菌(S.solfataricus)Sso10b、嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)Sac10b蛋白已有较多研究,推测这些蛋白可能在染色体组织和包装、DNA重组、基因表达调控等方面起作用。克隆并在大肠杆菌中表达了ssh10b2基因,纯化了重组Ssh10b2蛋白。免疫印迹定量分析表明,ssh10b2在芝田硫化叶菌中有表达,但其细胞含量仅相当于Ssh10b的约十分之一。重组Ssh10b2对双链DNA的亲和力低于Ssh10b。此外,Ssh10b2和Ssh10b在与双链DNA结合时表现出相似的凝胶阻滞模式。有意思的是,Ssh10b2固定DNA负超螺旋的能力明显低于Ssh10b。这些结果提示,Ssh10b和Ssh10b2可能具有不同的生理作用。

麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在巴斯德酵母中的表达及遗传稳定性

海藻糖是一种具有很多功能的非还原性二糖,在生物制品和食品等行业中具有较广泛的用途.对来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)B12海藻糖酶转化过程中的关键酶基因--麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因进行了遗传密码子的人工改造,合成酵母偏爱密码子和修改基因遗传密码子中的A/T含量,然后将完整的MTHase基因克隆到酵母表达载体pPICZαA,筛选出重组载体并将其导入巴斯德酵母(Pichia pastoris)细胞进行重组表达以用于海藻糖的酶转化.最后获得了一株高效稳定表达MTHase的酵母菌株,分泌到表达培养基上清中的MTHase的酶活大于800U/mg(蛋白质),该重组菌株遗传稳定率达84%以上,为工业化酶法生产海藻糖奠定了一定基础.

巩义新见绞胎枕的年代及其相关问题

2015年5月,巩义市文物考古研究所在配合巩义东区一处工地的考古发掘中,清理了一座梯形竖穴墓道的土洞墓。该墓出土了一件通体施绿色釉的绞胎枕,枕面上的团花图案采用了白褐两色绞胎工艺。通过对所见相关材料的比较研究,认为同类绞胎枕应为北宋早期芝田窑的产品。