补骨脂及其主要成分对人正常肝细胞L02的损伤作用研究

目的:对比研究补骨脂及其主要成分(补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂酚、补骨脂定)对人正常肝细胞L02的损伤作用差异。方法:以L02肝细胞系作为评价模型,采用MTT方法检测不同时间点(24,48,72 h)补骨脂及其主要成分对L02细胞增殖的影响;根据试剂盒说明书,采用生化法检测其对丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性及乳酸脱氢酶(LDH)释放率的影响。结果:500 mg生药量/L补骨脂950 mL/L乙醇提取物作用L02细胞24 h的抑制率为52.71%。相同时间点、相同质量分数下,补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂定和补骨脂酚对L02细胞的抑制率较高,而补骨脂素和异补骨脂素对L02细胞的抑制率相对较低;且补骨脂乙素、补骨脂酚对L02细胞的抑制率较补骨脂甲素和补骨脂定低。生化检测结果显示,补骨脂甲素和补骨脂定对LDH释放率的影响均大于补骨脂乙素、补骨脂酚、补骨脂素和异补骨脂素,但对ALT和AST活性无明显影响。结论:在一定质量分数范围内,补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂酚及补骨脂定对L02细胞均具有一定的细胞毒性,可能与补骨脂的肝损伤毒性有关;相同时间点、相同质量分数下,补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂定和补骨脂酚的毒性大于补骨脂素及异补骨脂素。

补骨脂不同溶剂提取物对前列腺增生小鼠干预作用比较

目的:比较补骨脂水提取物以及50%、75%、95%乙醇提取物对小鼠前列腺增生的干预作用,确定其发挥抗前列腺增生作用的最佳提取溶剂并对其抑制前列腺增生作用的活性成分进行初步探讨。方法:测定灌服补骨脂不同溶剂提取物及癃闭舒胶囊后的前列腺增生小鼠的前列腺系数,制备并观察小鼠的前列腺病理切片,同时对不同溶剂提取物中补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂乙素及补骨脂酚的含量进行测定,探究与其疗效的关系。结果:与模型对照组比较,各乙醇提取物组小鼠的前列腺系数均显著降低(P<0.01),而水提取物组与模型对照组比较差异无统计学意义(P> 0.05)。组织切片显示,除水提取物组外,其他各组小鼠的前列腺增生症状均明显减轻;其中75%乙醇提取物组和95%乙醇提取物组较50%乙醇提取物组的细胞层明显变薄、腺上皮褶皱明显减少(P<0.05)。含量测定结果显示,补骨脂提取物中上述5种成分含量较高的为75%乙醇提取物和95%乙醇提取物,两者相近;其次是50%乙醇提取物组,而水提取物组中各种成分的含量均较低。结论:补骨脂高浓度乙醇提取物能更好地发挥抗前列腺增生的作用,同时推测其对小鼠前列腺增生的抑制作用可能与补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂乙素及补骨脂酚这5种或其中的某些成分有关。

基于网络药理学和分子对接探讨四神丸治疗肠易激综合征的作用机制

目的:利用网络药理学技术和生物信息学方法探讨四神丸治疗肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)的活性成分、作用靶点及分子机制。方法:运用TCMSP、Pubchem、SEA、Swiss Target Prediction、GeneCards等数据库筛选四神丸活性成分、预测靶点及IBS疾病靶点;采用Cytoscape 3.7.2软件构建化合物-靶点-疾病网络和靶点蛋白相互作用网络;通过DAVID数据库进行基因本体功能富集分析和京都基因与基因组百科全书通路进行富集分析;利用AutoDock Tools软件进行活性成分和核心靶点的分子对接验证。结果:共筛选得到四神丸的活性成分18个,靶点693个,IBS相关疾病靶点422个,与四神丸的交集靶点共有82个;得出PPI网络的拓扑学分析结果,共筛选出20个关键靶点。GO富集条目644个,主要涉及炎症反应、平滑肌细胞增殖的正调控、蛋白激酶活性、MAP激酶活性的正调控、多巴胺分解代谢过程和白细胞介素-17产生的正调控等。KEGG通路显著富集148条,得出包括与IBS炎症与免疫相关通路、与细胞增殖与凋亡相关通路、与氧化应激和脂质过氧化相关通路等发挥治疗IBS作用的相关通路。分子对接结果显示芦丁、补骨脂酚、补骨脂甲素、金丝桃苷这4个活性成分能与IL1B、TLR4、IL6、TNF结合并形成较为稳定的构象。结论:网络药理学联用分子对接技术揭示四神丸可以通过多成分、多靶点、多途径治疗IBS。

不同炮制方法对补骨脂中手性成分含量变化的影响

目的考察经不同方法炮制前后补骨脂中补骨脂甲素(bavachin,BC)、补骨脂二氢黄酮甲醚(bavachinin,BVC)、补骨脂酚(bakuchiol,BAK)3种手性成分含量变化的差异,并结合分子对接技术初步明确此3种手性成分的对映异构体在毒性机制上的潜在差异。方法采用高效液相色谱-手性固定相(high performance liquid chromatography-chiral stationary phase,HPLC-CSP)法,通过改变流动相的比例,建立了补骨脂中3种手性成分的最佳分离方法,并比较来源于河南、四川、云南、辽宁4个产地的补骨脂经清炒法、盐炙法、酒浸法炮制前后各个对映异构体的含量差异。以前期筛选出的补骨脂致肝毒性作用靶标原癌基因酪氨酸激酶ABL1(Abelson tyrosine-protein kinase ABL1,ABL1)为对接主体,利用AutoDock Tools 1.5.7软件,对各个对映异构体分别进行分子对接。结果采用Chiralpak IG色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),在以乙腈-纯水(50∶50)为流动相,体积流量为0.5 mL/min,柱温为35℃的条件下,实现了补骨脂中各个对映异构体的最佳分离。在4个产地的补骨脂生品中,(R)-BC、(S)-BVC、(S)-BAK为其主要构型,经清炒法、盐炙法、酒浸法炮制后,(R)-BC含量降低,(S)-BC含量升高,(R)-BVC、(S)-BAK的含量降低率分别高于其S、R构型。分子对接结果显示,(R)-BC、(R)-BVC、(S)-BAK与毒性靶标的结合能力分别强于其对映异构体。结论补骨脂中3种手性成分的对映异构体的含量存在显著差异,经不同方法炮制后其含量变化也呈现明显区别,表明清炒法、盐炙法、酒浸法均能对补骨脂起到减毒作用。各个对映异构体与毒性靶标的相互作用能力及作用强度存在立体选择性差异。

D-最优设计响应面法结合UHPLC优选补骨脂药材炮制工艺

目的采用D-最优设计响应面法结合UHPLC技术优选补骨脂药材炮制工艺。方法以补骨脂药材炮制工艺的关键参数闷润时间、炒制温度及加盐量为自变量,进行D-最优设计;以UHPLC检测获得的补骨脂药材中9种主要指标成分补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂定、补骨脂乙素、补骨脂宁、补骨脂查耳酮和补骨脂酚炮制前后的质量分数变化为因变量,进行响应面分析;并结合单因素试验优化炒制时间,优选出补骨脂药材炮制工艺。结果补骨脂药材的最佳炮制工艺为在100 g补骨脂药材中加入2.10 g盐,闷润12 h,在80℃炒制30 min。结论利用D-最优设计响应面法结合UHPLC能够优选补骨脂药材炮制工艺参数,提高炮制工艺的稳定性和重复性,为提高补骨脂盐炙品的质量均一性和临床用药安全性提供技术支持。

补骨脂药材UPLC指纹图谱建立及12种主要成分含量测定

目的建立补骨脂Psoralea corylifolia药材的UPLC指纹图谱,同时对其中12种成分进行含量测定,为其质量控制提供参考。方法采用Shim-pack GIST-HP色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.9μm);以水和乙腈为流动相,梯度洗脱,建立10个产地29个批次的补骨脂药材的UPLC指纹图谱,并采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012年版)进行相似度评价。同时测定了补骨脂药材中12种成分的含量。结果建立了补骨脂药材的UPLC指纹图谱,29批药材的相似度在0.827~0.989,共标定出21个共有峰,并指认出其中12个色谱峰。定量分析条件方法学考察结果良好,29批药材中补骨脂素、异补骨脂素、异补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、欧前胡素、补骨脂宁、补骨脂定、4,5-去氢异补骨脂定、补骨脂乙素、异补骨脂色烯查耳酮、补骨脂酚的质量分数依次为1.08~6.95、0.76~5.01、0~0.62、0.40~2.54、0.32~1.75、0~0.25,0.06~0.73、0.23~1.83、0~0.27、0.86~6.86、0.08~1.59、4.20~20.76 mg/g。结论UPLC指纹图谱结合多成分同时测定的方法,操作简便,结果准确、稳定,可为补骨脂药材的质量评价提供参考。

大孔吸附树脂结合斑马鱼评价富集纯化补骨脂总黄酮的工艺研究

目的研究大孔吸附树脂法结合斑马鱼评价富集纯化补骨脂总黄酮的制备工艺。方法以补骨脂的黄酮类代表成分(新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂二氢黄酮甲醚和corylifol A)为指标,考察不同类型大孔吸附树脂的静态、动态吸附和解吸附能力,优选大孔吸附树脂类型;综合斑马鱼形态变化和存活率,评价大孔吸附树脂有机溶剂残留的安全性,优选不同厂家大孔吸附树脂;进一步考察上样药液质量浓度、体积流量、上样量、吸附时间、洗脱剂乙醇体积分数和用量等因素对黄酮纯化工艺的影响,并对优选纯化工艺进行验证,比较大孔吸附树脂纯化前后新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂二氢黄酮甲醚、corylifol A、补骨脂宁、补骨脂定、补骨脂乙素、4′-O-甲基补骨脂查耳酮、补骨脂素和异补骨脂素(黄酮类和香豆素类),以及补骨脂酚的含量。结果优选出D101大孔吸附树脂对补骨脂黄酮成分同时具有较好的吸附能力和解吸附能力;10个厂家D101大孔吸附树脂醇浸液对斑马鱼形态和致死率的影响差别较大,其中D2和D5的大孔吸附树脂安全性较好。优化的D101大孔吸附树脂纯化总黄酮制备工艺为补骨脂药液上样质量浓度为0.5 g/mL生药,上样量为1倍柱体积(BV),上样体积流量为1 mL/min,吸附时间为1.5 h,用1 BV 30%乙醇洗去未被吸附的成分,再用4 BV 90%乙醇洗脱黄酮成分,所得补骨脂总黄酮提取物中8种黄酮成分含量约是纯化前的1.3~5.1倍,黄酮成分总量约占上述所测11种成分总量的93.6%,提取物中总黄酮质量分数约为54%。结论斑马鱼评价可快速辨别大孔吸附树脂的安全性差异,D101大孔吸附树脂可有效富集纯化补骨脂黄酮类成分,优选的工艺简单、稳定、重复性好。

基于雷公法结合盐炙法对补骨脂的炮制及肝毒性评价

目的基于雷公法结合盐炙法对补骨脂进行炮制减毒并评价补骨脂炮制前后的肝毒性变化。方法建立高效液相色谱法同时测定补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素和补骨脂酚6个指标成分的含量;选取醇浓度、醇浸时间和蒸制时间为考察因素,以指标成分含量下降率的综合加权评分为指标,正交试验优化炮制工艺,并通过小鼠肝毒性实验评价补骨脂炮制前后的肝毒性。结果补骨脂最佳炮制工艺,按《中国药典》2020年版盐炙法制备盐补骨脂,取盐补骨脂适量,加入5倍量80%乙醇浸泡24 h,倒出乙醇并用蒸馏水洗净,加入5倍量蒸馏水,浸泡12 h,倒出蒸馏水并洗净,置蒸锅内隔水蒸4 h,取出晾干;由该法炮制所得的补骨脂炮制品中毒性成分含量明显下降,小鼠肝毒性显著降低。结论该炮制方法可明显降低补骨脂的肝毒性,为临床合理炮制补骨脂提供参考。

龙骨安神酒HPLC特征图谱及10个成分含量测定研究

目的:建立龙骨安神酒HPLC特征图谱并测定斯皮诺素、金丝桃苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素、宝藿苷Ⅰ、五味子醇甲的含量,为龙骨安神酒的质量控制提供参考。方法:采用Agilent Zorbax SB-C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈-水溶液为流动相进行梯度洗脱,体积流量为1.0 mL·min^(-1),柱温为30℃,检测波长为270 nm;通过相似度评价,结合聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)及偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)对12批龙骨安神酒的指纹图谱进行分析评价,并对指认的10个指标成分进行定量测定研究。结果:建立了龙骨安神酒特征指纹图谱,共标定了15个共有峰,各批次样品的相似度均大于0.9;12批龙骨安神酒样品质量存在一定的差异,筛选出对质量影响较大的5个关键成分,分别为斯皮诺素、金丝桃苷、朝藿定C、淫羊藿苷、补骨脂素;10种成分的线性关系良好(r≥0.9996),含量范围分别为10.59~18.59、48.51~61.11、13.74~20.78、13.05~20.05、231.82~271.29、113.77~148.98、60.89~80.58、58.90~71.68、17.91~21.17、64.09~76.34μg·mL^(-1)。结论:建立的龙骨安神酒特征图谱及10个成分含量测定的方法,简便、准确可靠,可用于龙骨安神酒的质量控制。