苦荞种子萌发过程芦丁降解酶的代谢规律

利用等吸收紫外分光光度法检测苦荞萌发过程中芦丁降解酶的活性,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)活性染色分析苦荞粉和萌发过程芦丁降解酶的同工酶谱,并对萌发过程黄酮质量分数的变化进行了分析。结果表明,建立的芦丁降解酶PAGE分析方法可以用于该酶的同工酶分析,苦荞种子中芦丁降解酶有4种同工酶。活性及同工酶电泳分析显示芦丁降解酶在种胚和内种皮中均有分布,胚中芦丁降解酶活性在籽粒萌发3 d内无明显变化,在萌发第4天开始迅速下降,至胚为子叶完全吸收后活性消失,而内种皮中芦丁降解酶在萌发过程中一直保持较高活性。整个萌发过程总黄酮呈上升趋势。推测芦丁降解酶在种子的萌发期并无新的合成。

野生荞麦籽粒中芦丁降解酶的分离纯化

从野生荞麦种金荞麦籽粒中提取出芦丁降解酶,具有将芦丁降解为槲皮素的作用。该粗酶液用葡聚糖凝胶柱G-100和DEAE阴离子交换柱分离纯化后,最终酶的比活性由59.2 U/mg提高到671.4 U/mg,纯化倍数和回收率分别为11.3倍和3.5%。所得酶液经SDS-PAGE检测酶分子量大小为60 kDa左右。对酶液反应条件进行研究,发现酶的最适温度为40℃,最适pH值为5.0。在工业生产上可借助芦丁降解酶以酶解法取代酸解法生产槲皮素。

苦荞籽粒芦丁降解酶的纯化、酶学性质及部分一级结构分析

芦丁降解酶催化芦丁降解为水溶性降低的槲皮素,是形成苦荞苦味的主要因素。研究以榆6-21苦荞籽粒粉为材料,通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析、阳离子交换层析、凝胶过滤层析分离纯化芦丁降解酶,SDS-PAGE显示纯化的芦丁降解酶为分子量66 kDa的单一条带。芦丁降解酶的最适pH值为5.0,最适温度为50℃。对其催化特性研究表明,该酶的K_m值为0.27 mmol/L,V_(max)值为39.68 U/mg。Cu^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)和EDTA对其有不同程度的抑制作用。纯化的芦丁降解酶可耐受50%(V/V)的甲醇。Edman降解法测定其N端序列为TVSRSSFPDGFLFGL。MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)二级质谱获得了其15个内肽序列。该研究为从转录组数据中确定芦丁降解酶的候选基因及深入研究芦丁降解酶的生物学功能奠定了基础。

化学酶法转化羟乙基芦丁合成槲皮素

槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物,其药理作用包括抗过敏、抗炎、抗癌等。工业上生产曲克芦丁产生的母液中含有未被利用的羟乙基芦丁,为实现母液羟乙基芦丁的回收利用,本文从羟乙基芦丁的结构出发,提出了一种化学法与酶法结合的方法将羟乙基芦丁转化为槲皮素。首先采用化学法实现羟乙基芦丁到芦丁的转化,反应收率为89.26%。其次在毕赤酵母中异源表达芦丁降解酶,并优化其芦丁转化槲皮素的反应体系,结果表明在底物浓度为2 mmol/L、酶添加量为15%(体积分数)、pH=5.0、温度为55℃时产率最高,最终酶法产率为53.96%。最后尝试以化学法得到的芦丁为酶法的底物,最终整体的转化率为47.17%。

不同提取条件对苦荞籽粒中芦丁降解的影响

本实验研究了不同提取条件对苦荞籽粒中芦丁含量的影响,经HPLC分析,浓度高于40%(v/v)的乙醇对芦丁降解酶有明显的抑制作用,其中90%乙醇的抑制作用最强。苦荞粉与水接触的时间强烈影响芦丁的含量,接触1min芦丁含量迅速由原来的79.72%下降到32.21%,即约60%的芦丁被降解。在pH1.0～11.0范围内,芦丁降解酶具有很强的抗酸碱性。当温度大于60℃时,芦丁降解酶开始缓慢失活,芦丁得以较好保存,高于70℃时芦丁保存率更高;当温度为90℃,芦丁保存率约为对照值的80%。该研究结果对于苦荞芦丁的提取和苦荞食品的加工具有重要的理论意义和实际指导价值。

苦荞茶和荞麦面条中芦丁及槲皮素含量分析

采用高效液相色谱法分析苦荞茶和荞麦面条中的芦丁和槲皮素含量。结果表明:造粒型和非造粒型(全麦和全胚)苦荞茶中芦丁和槲皮素的含量(质量分数)具有明显差异,非造粒型苦荞茶中芦丁的质量分数较高(0.518 3%～0.850 6%),槲皮素的质量分数较低(0.057 3%～0.252 1%);而造粒型苦荞茶和荞麦面条中槲皮素的质量分数较高(0.481 6%～1.022 2%,0.034 9%～0.072 0%),芦丁的质量分数较低(0.029 7%～0.031 4%,0.008 1%～0.024 4%),这可能是由于荞麦中存在的芦丁降解酶分解芦丁产生槲皮素的缘故。由此可见,并非所有的苦荞茶和荞麦面条都是以芦丁作为主要的黄酮类物质,单纯以芦丁和总黄酮的质量分数来评价荞麦制品的品质是不准确的。

不同提取条件对苦荞粉中芦丁提取率的影响

研究了不同提取条件对苦养粉中芦丁提取率及芦丁降解的影响,设计正交试验,优化芦丁提取工艺条件,优化提取条件为:体积分数为50%的乙醇溶液,料液比(g:mL)1:10,60℃条件下提取1h,提取2次。采用薄层层析法(TLC),分析了低体积分数乙醇溶液中,芦丁在芦丁降解酶的作用下降解,有乙基-β-芸香糖苷的生成。因此,为保证芦丁的高效提取,乙醇体积分数应高于50%。

苦荞壳中黄酮提取工艺的研究

研究了芦丁降解酶在不同浓度乙醇中的活性,并利用正交实验优化了苦荞壳中黄酮的提取工艺,最佳条件为:用30倍原料重的80%乙醇溶液,在70℃条件下提取2h。