芪灵扶正清解方对Huh-7细胞能量代谢及糖酵解相关蛋白的影响

目的 探讨芪灵扶正清解方(QFQ)对Huh-7细胞能量代谢及糖酵解相关蛋白的影响。方法CCK8法检测0、62.5、125、250、500μg/mL QFQ醇提物干预Huh-7细胞24、48和72 h后的细胞活力。将Huh-7细胞分为0、62.5、125、250、500μg/mL组,分别予相应浓度的QFQ醇提物干预24 h,应用细胞能量代谢分析仪检测线粒体和糖酵解ATP产生速率、实时耗氧率、胞外酸化率、糖酵解速率和质子流出速率;Western blot检测Huh-7细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、己糖激酶(HK)、葡萄糖转运蛋白(Glut)1以及Glut3的蛋白表达量。结果(1)与0μg/mL组比较,125、250、500μg/mL QFQ醇提物干预Huh-7细胞24、48和72 h后细胞活力明显降低(P<0.01)。(2)与0μg/mL组比较,62.5、125、250μg/mL组Huh-7细胞线粒体和糖酵解ATP产生速率比值明显提高(P<0.05),125、250μg/mL组Huh-7细胞糖酵解速率明显降低(P<0.05或P<0.01);与0μg/mL组比较,随着检测时间延长,62.5μg/mL组Huh-7细胞实时耗氧率呈升高趋势(P<0.05),250μg/mL组Huh-7细胞胞外酸化率和质子流出速率呈降低趋势(P<0.05)。(3)与0μg/mL组比较,62.5、125、250、500μg/mL组Huh-7细胞的HIF-1α、HK、Glut1、Glut3蛋白表达量均明显降低(P<0.01或P<0.05)。结论 QFQ通过调控细胞能量代谢和糖酵解相关蛋白HIF-1α、HK、Glut1和Glut3的表达,提高线粒体能力,抑制糖酵解能力,促进有氧呼吸,从而有效抑制Huh-7细胞的增殖。

基于自噬探讨芪灵扶正清解方抗抑郁作用研究

目的观察芪灵扶正清解方对抑郁模型大鼠行为学及海马神经元微结构的影响,探讨其对自噬相关蛋白、基因的调节及其抗抑郁机制。方法30只SD大鼠随机分3组:正常组、模型组、芪灵组。正常组不干预,其余2组以慢性不可预知温和应激联合孤养建立抑郁大鼠模型。各组大鼠进行糖水消耗实验、敞箱实验行为学观察;HE染色观察海马细胞形态;透射电镜观察海马细胞超微结构及自噬变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测Ulk1、Beclin1、P62、LC3蛋白和mRNA的表达;免疫组织化学染色法(IHC)检测海马组织Beclin1表达。结果行为学实验提示:与正常组比较,模型组大鼠糖水消耗量明显降低(P<0.05);直立次数、水平穿越的格数和理毛时间减少,粪便粒数和中央格停留时间增加(P<0.05);与模型组比较,芪灵组大鼠糖水消耗量明显增加(P<0.05);直立次数、水平穿越的格数和理毛时间增加,粪便粒数和中央格停留时间减少(P<0.05)。HE染色提示:与正常组比较,模型组海马CA3区细胞数量减少,排列紊乱,部分细胞核模糊;CA1区细胞形态不规则,数量稀疏,体积明显变大,排列紊乱,细胞核模糊;与模型组比较,芪灵组海马CA1区、CA3区细胞形态相对规则,细胞数量相对较多,排列相对齐整,细胞体积相对正常,细胞核较清晰。透射电镜显示:与正常组比较,模型组大鼠海马区神经细胞形态不规则,线粒体结构损伤严重,细胞自噬的表征数量较为丰富;与模型组比较,芪灵组神经细胞形态相对规则,线粒体损伤相对轻微,细胞自噬的表征数量较少。Western blot与qPCR实验提示:与正常组比较,模型组大鼠的Ulk1、Beclin1、LC3-II蛋白和mRNA的表达增加(P<0.05),P62蛋白和mRNA的表达减少(P<0.05);与模型组比较,芪灵组大鼠的Ulk1、Beclin1、LC3-II蛋白和mRNA的表达减少(P<0.05),P62蛋白和mRNA的表达增加(P<0.05)。IHC实验提示:与正常组比较,模型组大鼠海马CA3区Beclin1表达增加(P<0.05);与模型组比较,芪灵组大鼠CA3区Beclin1表达减少(P<0.05)。结论CUMS联合孤养诱导的抑郁模型大鼠海马神经元CA1区、CA3区首先出现损伤性改变,CA3区可能首先出现自噬异常激活;芪灵扶正清解方能改善抑郁模型大鼠的行为学指标,对其海马神经细胞具有一定的神经保护作用,其抗抑郁机制可能与调节海马细胞异常自噬有关。

杜建教授应用芪灵扶正清解方治疗肺癌术后临床经验

杜建教授认为肺癌术后的病因病机应当重视手术、放疗和化疗带来的影响,杜建教授运用温病学理论,灵活结合扶正法与清解法,从肺脾肾同治的角度出发,攻补兼施,创立了芪灵扶正清解方,根据肺癌患者气滞、痰湿、血瘀等兼证,以芪灵扶正清解方为基础辨证加减,疗效显著。

从Cyclin E1-CDK2-CKIs通路探讨芪灵扶正清解方抑制肝癌细胞株Hep1-6增殖的作用机制

目的从周期蛋白Cyclin E1-细胞周期依赖性蛋白激酶2(CDK2)-CDKs抑制因子CKIs(Cyclin E1-CDK2-CKIs)信号通路角度探讨芪灵扶正清解方(QL)调控小鼠肝癌Hep1-6细胞株增殖的机制.方法体外培养Hep1-6细胞,分别给予不同剂量的QL醇提物(0、31.25、62.5、125、250、500、1000μg/mL)干预Hep1-6细胞株24h、48h和72h.MTT法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞周期各个时相的比例;Western blot检测CDK2、周期蛋白Cyclin E1、视网膜母细胞瘤Rb、磷酸化Rb(p-Rb)以及CDKs抑制因子(CKIs)p57^(KIP2)和p27^(KIP1)的蛋白水平.结果QL醇提物能显著抑制Hep1-6细胞的生长活力,呈剂量依赖性;Hep1-6细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期的DNA合成被抑制;QL醇提物下调了CDK2、Cyclin E1、p-Rb的蛋白水平,上调了p57^(KIP2)和p27^(KIP1)的蛋白水平.结论QL方通过抑制CDK2与Cyclin E1的结合,同时正向调控CKIs抑制Cyclin E1-CDK2复合物的激酶活性,从两方面抑制下游Rb的磷酸化水平,进而有效抑制肝癌Hep1-6细胞的增殖.