芪甲柔肝方及其拆方调控VEGF/SRF/c-FOS通路与改善肝纤维化大鼠肝窦毛细血管化的机制研究

基于血管内皮生长因子(VEGF)/血清应答因子(SRF)/原癌基因c-FOS(c-FOS)通路及肝窦毛细血管化揭示芪甲柔肝方及其拆方抗肝纤维化的机制。将大鼠随机分为空白组(6只)和造模组(28只),造模组大鼠采用皮下注射40%四氯化碳(CCl_4)橄榄油的方法建立肝纤维化模型。确定造模成功后,将造模组剩余大鼠分为模型组(7只)、芪甲柔肝全方组(6只)、拆方益气养血药组(6只)、拆方化瘀通络药组(6只),芪甲柔肝全方组、拆方益气养血药组、拆方化瘀通络药组分别采用中药灌胃治疗,空白组与模型组给予生理盐水灌胃。灌胃28 d后处死大鼠,检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)判断肝功能,肝组织苏木素-伊红(HE)染色、马松(Masson)染色观察肝脏炎症及纤维化,检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)判断肝星状细胞激活,检测肝组织血管内皮生长因子A(VEGFA)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)、SRF、c-FOS、分化抗原簇31(CD31)、血管性血友病因子(vWF)的表达水平,扫描电镜观察肝窦内皮细胞窗孔形态以揭示各组药物抗肝纤维化的机制。结果显示,与模型组相比,芪甲柔肝方及其拆方益气养血药、化瘀通络药均能减轻肝组织病理损伤,降低肝纤维化大鼠ALT、AST和肝指数(P<0.01);各治疗药物均能降低肝组织α-SMA和collagenⅠ表达(P<0.01),降低肝纤维化大鼠肝组织CD31和vWF的表达(P<0.05),维持肝窦内皮细胞窗孔形态;各治疗药物均能降低VEGFA、SRF、c-FOS的表达(P<0.05),恢复VEGFR-2的表达(P<0.05)。其中,芪甲柔肝全方在改善大鼠肝损伤与血清肝功能,抑制肝窦毛细血管化,以及调控VEGF/SRF/c-FOS信号通路方面优于拆方的益气养血药及化瘀通络药(P<0.05)。综上,芪甲柔肝方及其拆方均能够改善肝纤维化大鼠肝功能,减轻病理损伤,抑制肝星状细胞激活,减轻肝纤维化及肝窦毛细血管化,其机制与调控VEGF/SRF/c-FOS信号通路有关。单用化瘀通络药不及联合益气养血药的芪甲柔肝全方,提示荣通并治在肝纤维化及肝窦毛细血管化的积极意义。

基于IKKβ/NF-κB通路研究芪甲柔肝方抗肝纤维化作用机制

目的:研究芪甲柔肝方改善肝纤维化可能机制。方法:将68只SPF级雄性SD大鼠随机分为空白组(10只)和造模组(58只)。造模组采用皮下注射CCl4花生油+10%乙醇代水饮的方式建立肝纤维化模型。造模成功后,将造模组大鼠随机分为模型组、芪甲柔肝组、鳖甲煎丸组,各组分别予相应药液灌胃,每日1次,连续6周。HE染色和Masson染色观察大鼠肝组织病理学及胶原沉积情况;全自动血清生化仪检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)的表达水平;酶联免疫吸附法测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达情况;免疫组化法检测肝组织α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、核转录因子p65(NF-κB p65)、IκB激酶β(IKKβ)蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠AST、ALT、ALP和TNF-α水平显著升高(P<0.05),病理见模型组肝细胞排列紊乱,大量纤维纵隔、假小叶生成,α-SMA、NF-κB p65和IKKβ蛋白表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,芪甲柔肝组和鳖甲煎丸组大鼠AST、ALT、ALP和TNF-α水平显著降低(P<0.05),α-SMA、NF-κB p65和IKKβ蛋白表达显著降低(P<0.05)。上述病理均有改善。结论:芪甲柔肝方具有改善肝损伤、抗炎及抗纤维化的作用,这可能与抑制IKKβ/NF-κB信号通路激活有关。

基于miR-23a-3p的扶正通络法抗肝纤维化的机制

目的:研究扶正通络法验方芪甲柔肝方抗肝纤维化的疗效与机制。方法:采用皮下注射四氯化碳(CCl4)花生油+10%乙醇代替饮水的方式建立大鼠肝纤维化模型,随机将大鼠分为空白组,模型组,芪甲柔肝方高、中、低剂量组及鳖甲煎丸组,分别以0.9%氯化钠溶液,高、中、低剂量芪甲柔肝方水煎剂,鳖甲煎丸混悬液灌胃,疗程为6周。检测肝功能、肝指数与血清纤维化标志物以判断疗效,并用qRT-PCR检测大鼠肝miR-23a-3p的表达,结合生物信息学分析其调控机制。结果:(1)与空白组比较,模型组大鼠ALT、AST、肝指数及血清纤维化标志物(PⅢP、PCⅣ、HA、LN)显著升高(P<0.05),肝组织显示明显的炎症与纤维化,并出现大量假小叶。与模型组比较,芪甲柔肝方高、中、低剂量组及鳖甲煎丸组均能在一定程度上改善上述指标,其中芪甲柔肝方高剂量组与鳖甲煎丸组疗效最为显著;(2)与空白组比较,模型组miR-23a-3p表达显著降低(P<0.05),芪甲柔肝方高剂量组与鳖甲煎丸组能显著升高miR-23a-3p的表达(P<0.05);(3)miR-23a-3p的靶基因主要参与调控p53、磷脂酰肌醇等通路。结论:芪甲柔肝方治疗CCl4+乙醇的复合造模诱导的大鼠肝纤维化,可显著改善肝功能,降低血清纤维化标志物,减轻肝组织的炎症及纤维化程度,其作用机制可能与上调miR-23a-3p的表达,调控p53、磷脂酰肌醇等通路有关。