基于Nrf2/ARE信号通路研究芪黄补肾泄浊方对糖尿病肾病HMC细胞的保护机制

目的:探讨芪黄补肾泄浊方对高糖培养下人肾小球系膜细胞(HMC)核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件信号通路表达的影响及其对氧化应激的保护作用。方法:离体培养HMC,制备正常大鼠血清,大鼠灌胃给予厄贝沙坦及芪黄补肾泄浊方,达到血药浓度后制备含药血清,实验分为对照组、高糖组、厄贝沙坦组及芪黄补肾泄浊方组。对照组HMC给予正常大鼠血清(10%血清浓度)培养液培养,高糖组HMC予大鼠血清(10%血清浓度)的高糖培养液培养,厄贝沙坦组与芪黄补肾泄浊方组分别给予10%剂量厄贝沙坦与10%剂量芪黄补肾泄浊方含药血清高糖培养液干预培养,培养48 h后收集相关指标检测。采用Real⁃time PCR定量分析的方法检测各组HMC中核因子E2相关因子(Nrf2)、γ⁃谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ‐GCS)、超氧化物歧化酶(SOD)的mRNA表达水平。免疫细胞化学法检测各组HMC中γ⁃GCS和SOD的表达;采用Western blot的方法观察各组HMC中γ⁃GCS、SOD蛋白表达的情况。结果:各组实验细胞Nrf2、γ‐GCS、SOD mRNA、蛋白的表达,在对照组中只有少量,高糖组较对照组减少(P<0.05),厄贝沙坦与芪黄补肾泄浊方干预后增加,且以芪黄补肾泄浊方组增加更显著(P<0.05)。结论:芪黄补肾泄浊方可改善高糖培养下HMC氧化应激损伤,其作用机制可能是通过激活Nrf2及其相关下游蛋白γ⁃GCS和SOD达到的。

芪黄补肾泄浊方对肾小球系膜细胞Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的:探讨芪黄补肾泄浊方对人肾小球系膜细胞(HMC)核转录因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶(HO-1)信号通路的影响。方法:体外培养HMC细胞,制备芪黄补肾泄浊方的大鼠含药血清,并用芪黄补肾泄浊方药物血清干预,实验分5组,即正常对照组(A组)、高糖组(B组)、芪黄补肾泄浊方低剂量组(C组)、芪黄补肾泄浊方中剂量组(D组)、芪黄补肾泄浊方高剂量组(E组)。A组HMC给予正常大鼠血清的培养液(血清浓度10%)培养,B组HMC予含正常大鼠血清的高糖培养液(血清浓度10%)培养,C组予含芪黄补肾泄浊方低剂量含药血清的高糖培养液(血清浓度10%)培养干预,D组予含10%芪黄补肾泄浊方中剂量含药血清的高糖培养液(血清浓度10%)培养干预,E组予含10%芪黄补肾泄浊方高剂量含药血清的高糖培养液(血清浓度10%)培养干预,分别于培养48 h末收集细胞进行相关实验指标测定。免疫细胞化学检测方法分析Nrf2及HO-1的表达;运用Western Blot的方法从蛋白质水平观察芪黄补肾泄浊方对HMC Nrf2、HO-1蛋白表达的影响。Real-time PCR定量分析的方法在基因水平探究芪黄补肾泄浊方对HMC中HO-1mRNA表达水平的影响。结果:各组细胞培养48 h末免疫细胞化学法检测结果显示:B组细胞内Nrf2、HO-1的表达显示较A组减少,与B组比较,各药物血清组(C组、D组及E组)细胞内Nrf2、HO-1的表达明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示:与A组比较,Nrf2、HO-1在B组细胞内的表达减少,C组、D组及E组与B组比较,细胞内Nrf2、HO-1的表达明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。Real-time PCR研究结果显示,各组细胞HO-1mRNA在正常对照组可有少量表达,48 h末高糖组较对照组表达减少,不同剂量芪黄补肾泄浊方药物血清刺激后表达增加,且以中剂量组和高剂量组表达增加更明显(P<0.05)。结论:芪黄补肾泄浊方对高糖培养下HMC氧化应激损伤有改善作用,其作用机制可能是通过激活Nrf2/HO-1信号通路实现的。

Notch信号通路在慢性肾衰竭中的表达及芪黄补肾泄浊方的肾保护作用

目的 探讨芪黄补肾泄浊方对UUO大鼠模型Notch信号通路表达的影响,探讨其延缓慢性肾衰竭(CRF)肾间质纤维化(RIF)进展的机制。方法 将80只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、芪黄补肾泄浊方组(芪黄补肾组)与厄贝沙坦组,每组20只。采用左侧输尿管完全梗阻法(UUO)建立慢性肾衰竭肾间质纤维化模型,大鼠灌胃,芪黄补肾泄浊方组及厄贝沙坦组给予相应药物水溶液灌胃,假手术组与模型组给予等体积蒸馏水灌胃,每日1次。观察大鼠一般状态;收集大鼠尿液、血清进行尿量、24hUPQ、血清肌酐、血清尿素氮检测;收集各组大鼠梗阻侧肾组织,HE、Masson染色观察肾脏病理改变。免疫组化法观察Notch1、Jagged1和Hes1蛋白表达;Real-Time PCR法检测Notch1 mRNA、Jagged1 mRNA、Hes1 mRNA基因转录;Western blot法检测Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表达。结果 与假手术组相比,模型组大鼠状态差,皮毛暗淡,反应迟钝,活动减少,喜蜷卧,饮食量明显减少,芪黄补肾泄浊方可以改善UUO大鼠一般状态,且优于厄贝沙坦组。模型组大鼠24hUPQ、血清肌酐及血清尿素氮与假手术组相比明显升高(P<0.05);芪黄补肾泄浊方及厄贝沙坦可降低UUO大鼠24hUPQ、血清肌酐及血清尿素氮水平(P<0.05)。HE及Masson染色结果显示:与模型组比,芪黄补肾泄浊方可改善UUO大鼠肾脏的病理变化程度,可减少UUO大鼠肾组织纤维化面积百分比(P<0.05)。免疫组化、Real-Time PCR、Western blot结果显示:在大鼠肾组织中,与假手术组相比,Notch1、Jagged1、Hes1蛋白及mRNA表达在模型组明显增加(P<0.05),在芪黄补肾组、厄贝沙坦组中的表达均少于模型组(P<0.05),且芪黄补肾组少于厄贝沙坦组(P<0.05)。结论 芪黄补肾泄浊方可改善肾功能,延缓慢性肾衰竭肾间质纤维化,其作用可能与降低Notch1mRNA、Jagged1mRNA、Hes1mRNA基因转录,下调Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表达,从而抑制Notch信号通路有关。