多胺与番茄对烟草花叶病病毒抗性关系的研究

试验结果表明，番茄的抗病品种中游离态Ｐｕｔ（腐胺）和Ｓｐｄ（亚精胺）的含量较高，且游离态Ｓｐｄ／Ｓｐｍ（精胺）显著高于感病品种。番茄植株中结合态Ｐｕｔ和Ｓｐｄ的含量低于游离态且感病品种高于抗病品种。ＴＭＶ（烟草花叶病病毒）侵染使得番茄抗、感品种植株体内游离态和结合态多胺的水平不同程度地提高。一般地说，Ｐｕｔ的含量在接种后４８ｈ之前大量合成，而Ｓｐｍ的含量在接种４８ｈ之后上升幅度较大。总之，较高含量的游离态Ｐｕｔ和Ｓｐｄ及较大的游离态Ｓｐｄ／Ｓｐｍ值有利于植株抗病。

不同地区小麦梭条花叶病病毒致病力的差异

为了研究小麦梭条花叶病病毒的致病力及其与品种(系)抗病性的互作关系,应用采集自江苏苏州、江宁、兴化、宜兴和六合五个不同地区的小麦梭条花叶病病土,测定了30个小麦品种(系)在上述病土中的发病情况。结果表明,30个小麦品种(系)对梭条花叶病毒的抗性表现为3种类型即广谱抗型、部分抗型和广谱感型;小麦梭条花叶病毒致病力有明显的区域性差异,存在着显著的致病力分化现象;病毒致病力和品种(系)间存在互作效应。

广西蔗区甘蔗花叶病病毒种群分析

【目的】明确引起广西蔗区甘蔗花叶病的病原,为甘蔗抗花叶病育种、种质筛选及病害防控提供科学依据。【方法】从广西主要蔗区采集不同品种显症或不显症甘蔗叶片,提取RNA后采用甘蔗花叶病毒(SCMV)、高粱花叶病毒(Sr MV)、玉米矮化病毒(MDMV)和约翰逊草花叶病毒(JGMV)特异引物进行一步法RT-PCR检测,将目的片段克隆并测序;病毒CP基因序列在Gen Bank数据库中进行比对分析。【结果】在收集的48份样品中检测出Sr MV阳性33份,SCMV阳性2份,SCMV和Sr MV复合侵染1份,未检测到MDMV和JGMV。花叶病的发病率为75.0%,其中,Sr MV、SCMV及两种病毒复合侵染的发病率分别为68.8%、4.2%和2.1%。台糖系列及其他引进品种的甘蔗花叶病感病率较高,桂糖系列品种的感病率相对较低。【结论】甘蔗花叶病已在广西大部分蔗区发生,其致病原以Sr MV为主,SCMV零星发生,由SCMV和Sr MV复合侵染的甘蔗花叶病发生机率较低。广西蔗区可能存在其他种类病原病毒引起的甘蔗花叶病。

关中地区甘蓝花叶病病毒种群鉴定

用血清检测和生物接种的方法,对陕西关中地区甘蓝花叶病的毒源性质鉴定归类结果,在春甘蓝上,TuMV占71.62％,TuMV+CMV占10.81％,CMV占16.22％,TMV占1.35％,秋甘蓝TuMV占53.19％,TuMV+CMV占20.21％,CMV占24.47％。未检出TMV,但另有2.13％的毒样属性质不明者。秋甘蓝上TuMV+CMV以及CMV的发生比率较春甘蓝显著增大。认为同秋季田间CMV毒源量及传毒介体发生量大有关。

永州烟区烟草花叶病病毒株系调查与分析

为了查明永州主要烟区TMV株系的归属,以采自永州烟区6县23个乡镇的91个普通花叶病烟草样品为材料,通过对TMV CP基因的克隆及序列分析,并与国内外报道的主要株系(或分离物)的同一基因进行比较,构建系统发育树,研究了永州主要烟区TMV病毒株系的分布及进化情况。结果表明:永州烟区的TMV来源混杂,数据库中存在的国内外代表性分离物均可以在永州烟区6县的样品中找到亲缘种,一些TMV分离物还发生了不同程度的变异,变异样品中有65.3%是采自发病率10%以上的烟田;在普通烟草花叶病毒的防控中,应注意农事操作的规范性,预防高致病力或高传播力变异株的出现。

青蒿中番茄斑萎病毒和烟草花叶病毒的分子鉴定及相关序列分析

番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)是2种重要的植物病原病毒,对多种经济作物的产量和品质均造成严重影响。2021年-2022年,在云南省丽江市烟草种植区不同烟区采集叶片黄化、皱缩以及无症状的青蒿Artemisia caruifolia样品共计14份,利用免疫金标速测卡和RT-PCR对其病原病毒进行检测。利用免疫金标速测卡检测结果显示,在所检样品中有9份样品检测出TSWV,检出率为64.28%,有3份样品检测出TMV,检出率为21.43%,2种病毒复合侵染的检出率同样为21.43%;利用RT-PCR对复合侵染的3份样品进行分子检测,结果显示,在3份复合侵染青蒿样品中获得3条TSWV N基因序列、3条TMV cp基因序列和2条TMV RdRp部分序列。TSWV青蒿分离物与分离自云南的TSWV-2分离物相似性最高,为99.6%;TMV青蒿分离物与分离自辽宁的TMV-Shenyang分离物和分离自云南的TMV-Yongren-1相似性最高,均大于99.4%。这是首次发现TSWV和TMV 2种不同属病毒复合侵染青蒿。

我国斯里兰卡木薯花叶病毒的分子特征及致病性分析

为进一步探究我国斯里兰卡木薯花叶病毒(Sri Lankan cassava mosaic virus,SLCMV)的分子特征及致病性。以感染SLCMV的木薯叶片基因组DNA为模板,PCR扩增获得DNA-A和DNA-B基因组全长,通过生物信息软件分析比较其核酸及氨基酸序列特征;构建了强、弱致病力分离物(SLCMV-Colombo和SLCMV-DG1922)的侵染性克隆,分别将2种致病力分离物的DNA-A和DNA-B组分进行重组,接种烟草(Nicotianatabacum),比较2种分离物的致病性差异。结果显示:我国SLCMV为“旧世界”双组份菜豆花叶病毒,编码包括AV2基因在内的8个开放阅读框(ORFs);具有双生病毒典型的共同序列(CR)、重复序列、TATABox和TAATATT↓AC茎环结构,Rep蛋白羧基末端有7个氨基酸缺失;我国SLCMV的基因组、编码和非编码区与柬埔寨、泰国和越南分离物的相似性在97.0%~100.0%之间,与印度和斯里兰卡早期的分离物相似性为86.5%~98.6%,DNA-B组份与印度木薯花叶病毒株系(ICMV)编码区序列相似性为95.0%~97.6%,与其他9个非洲木薯花叶病毒株系序列之间的序列相似性均低于80.0%。侵染性克隆接种结果证实,强致病力分离物SLCMV-Col的DNA-A(Col-A)组份在烟草叶片表现典型花叶症状中起主要作用,而我国分离物的DNA-B(DG1922-B)能协同Col-A对烟草产生强致病性。本研究分析了我国SLCMV的全基因组结构,建立的侵染性克隆及其技术为进一步解析SLCMV致病性机理提供重要的研究基础。

信前胡烟草花叶病毒lncRNA测序鉴定、原核蛋白表达及其序列分析

本研究对信前胡烟草花叶病毒进行鉴定、原核蛋白表达和序列分析,为信前胡脱毒苗的培育和鉴定提供理论依据。通过lncRNA测序和RT-PCR鉴定信前胡烟草花叶病毒蛋白基因,利用大肠杆菌重组技术表达信前胡烟草花叶病毒蛋白,并采用生物信息学方法进行序列分析。信前胡烟草花叶病毒蛋白基因包括复制酶(ORF1)、运动蛋白(ORF2)和外壳蛋白(ORF3);信前胡烟草花叶病毒复制酶、运动蛋白和外壳蛋白均可通过RT-PCR检测到,并可实现大肠杆菌重组表达,表明信前胡烟草花叶病毒的lncRNA测序结果准确;信前胡烟草花叶病毒复制酶、运动蛋白和外壳蛋白基因cDNA总长度分别为3351 bp、807 bp和480 bp;信前胡烟草花叶病毒复制酶、运动蛋白和外壳蛋白与烟草花叶病毒的亲缘关系较近,同源性分别为99.64%、98.88%、98.74%。信前胡烟草花叶病毒(Peucedanum praeruptorm tobacco mosaic virus,PpTMV)在江西省上饶市信前胡主产区信州、广信、玉山、广丰、婺源、德兴、弋阳的7个区或县均有发生。这是首次报道在信前胡上检测到PpTMV。

木薯花叶病毒AC4蛋白与AtPARN互作研究

木薯(Manihot esculenta Crantz)作为重要的热带作物,是全球六大粮食作物之一,并为全球近七亿人口提供主粮,然而病毒侵染引起的病害在全球范围内严重威胁木薯产业的发展。木薯花叶病毒病(cassava mosaic disease,CMD)是最有威胁的病害之一,造成严重的经济损失。斯里兰卡木薯花叶病毒(SriLankancassavamosaicvirus,SLCMV)是引发木薯花叶病的病原物之一,SLCMV是典型的双组分双生病毒,其基因组由DNA-A和DNA-B两个环状组分组成。无义介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)是真核细胞mRNA降解的主要途径之一,也是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。越来越多的研究显示,NMD不仅是真核生物重要的mRNA数量、质量调控机制,还与转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)同样能降解病毒RNA,是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。NMD的mRNA衰减过程包括PTC的识别、脱腺苷酸、脱帽和最后的核酸外切酶降解4个过程,UPF1、PARN、DCP2和XRN4分别是上述4个过程中的关键蛋白。病毒是专性寄生生物,必须逃避或耐受寄主细胞的降解,才能成功感染。聚腺苷酸特异性核糖核酸酶[poly(A)-specific ribonuclease,PARN]是NMD信号通路的一个关键因子。目前,关于SLCMV抵御寄主NMD的分子机制尚不明确。本研究采用酵母双杂交(yeast two-hybrid system)和荧光双分子互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验证明斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)编码的沉默抑制子AC4与拟南芥PARN相互作用。据此推测SLCMV AC4蛋白可能通过与AtPARN相互作用而抑制寄主NMD的病毒防御功能帮助病毒逃避或耐受寄主细胞的降解。研究结果为阐明木薯花叶病毒调控寄主NMD抗病毒防御功能的分子机理奠定基础。

河北保定地区黄瓜花叶病毒与马铃薯Y病毒复合侵染叶用莴苣分子鉴定

利用RT-PCR方法对采集自河北保定地区的疑似叶用莴苣病毒病样品进行分子生物学鉴定,并构建系统发育进化树。结果表明,特异性引物CMV和PVY分别扩增得到大小为260、420 bp的单一条带;通过核苷酸序列Blast比对及系统进化树分析,河北保定地区叶用莴苣病毒分离物分别与印度番茄CMV分离物(MN514839.1)、印度马铃薯PVY分离物(JX945850.1)聚在同一分支上,同源性分别为95%、92%。本研究首次检测到河北保定地区叶用莴苣病毒病是由CMV与PVY复合侵染所致。

RNA干扰防控烟草黄瓜花叶病毒的效果

烟草黄瓜花叶病毒病是危害烟草的重要病害之一,严重影响烟株田间生长发育。为防控烟草黄瓜花叶病毒病,根据已经构建的靶向沉默黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)相关基因的VIGS载体,使用单个载体和混合载体沉默与CMV有关的CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP和CMV-CP这4个病毒编码蛋白基因,测定基因沉默后CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP、CMV-CP相对表达量及CMV浓度,并评价VIGS对烟草黄瓜花叶病毒病的防治效果。结果表明:单独接种和混合接种4种载体烟株均能有效沉默相应靶基因的表达,单独接种时,对CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP、CMV-CP的沉默效率分别为10.78%、60.36%、32.92%、58.95%,pTRV2-CMV-2a载体单独接种对CMV-2a基因的沉默效率最高;混合接种对CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP、CMV-CP基因的沉默效率分别为18.78%、44.18%、28.33%、35.64%,混合接种也是对CMV-2a基因的沉默效率最高。接种VIGS-TRV载体的烟株在接种病毒后21 d内,单独接种和混合接种载体均有效下调CMV浓度,且混合接种的效果大于单一载体,有效地抑制烟株内CMV的传播,减轻烟草黄瓜花叶病毒病的发病率和病情指数,接种混合载体的效果最佳,为有效防控烟草黄瓜花叶病毒提供了新的方法。

苹果坏死花叶病毒CP基因原核表达及其抗血清制备

苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规检测方法尤为必要.通过设计特异性引物,以RT-PCR方法成功获得ApNMV CP基因序列,插入到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG进行重组蛋白(含His-tag)诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,用Ni Sepharose 6 Fast Flow进行蛋白纯化,回收共得到重组蛋白2.4 mg.在屏障环境下免疫2只SPF级新西兰兔,制备出多克隆抗血清,稀释400倍后仍能与ApNMV阳性苹果叶片样品发生免疫反应.由此证明,本研究建立的ApNMV间接ELISA检测方法具有较好的灵敏性,检测效率高,能够用于田间大量样品ApNMV的诊断.

椴叶鼠尾草抗烟草花叶病毒活性成分研究

为寻找新型植物病毒抑制剂,以烟草花叶病毒(TMV)为供试病毒,研究发现入侵植物椴叶鼠尾草提取物具有抗TMV活性。通过半叶枯斑法不同施药方式筛选发现,在质量浓度为1 mg/mL时,石油醚萃取物的保护作用和钝化作用最强,抑制率为40.95%和52.85%;乙酸乙酯萃取物的治疗作用最强,抑制率为52.85%,与阳性对照药剂宁南霉素无显著差异。石油醚萃取物各馏分中,Fr7的保护作用和治疗作用最好,抑制率为40.51%和45.52%,Fr6的钝化作用最好,抑制率为74.63%。乙酸乙酯萃取物各馏分中,Fr1′的保护作用最强,抑制率为61.77%,Fr3′的治疗作用最强,抑制率为55.02%,Fr4′的钝化作用最强,抑制率为60.22%。运用现代色谱波谱技术分离鉴定了5个化合物分别为tilifodiolide、eupatoric acid、熊果酸、齐墩果酸和2-甲基-5,7-二羟基色原酮。

基于RPA-CRISPR/Cas12a的番茄花叶病毒可视化检测方法的建立

番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)属于植物杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒属Tobamovirus成员,主要危害番茄和辣椒,多数茄科植物易感染,严重影响果实的品质和产量。本研究根据ToMV编码的外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)特异性引物和簇状规则间隔短链重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白12a(CRISPR-associated 12a,Cas12a)的crRNA并挑选报告基因。通过优化反应体系建立了ToMV的快速可视化检测方法,当荧光报告基因FQ终浓度为400 nmol/L、Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol·L^(-1)/1000 nmol·L^(-1)时检测信号最强,只需RPA和CRISPR/Cas12a分别反应15 min,即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信号。该方法可特异性检测ToMV,对携带ToMV样品的RNA检测灵敏度可以达到172 ag/μL,是普通RT-PCR检测灵敏度的10000倍,可用于ToMV快速灵敏的可视化检测。

两种丛枝菌根真菌和黄瓜花叶病毒复合作用对烟草生长和光合特性的影响

为研究丛枝菌根真菌(AM真菌)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的复合作用对烟草生长的影响,在大棚控制试验中,通过设置4个AM真菌处理水平(接种灭菌混合AM真菌、Funneliformis mosseae、Diversispora versiformis和两者混合菌种)和2个CMV处理水平(不接种和接种),从生理生态学角度来研究其调控作用。结果表明:接种CMV显著降低了未接种AM真菌烟草植株的总干重、净光合速率(Pn)和瞬时水分利用效率(WUE);接种AM真菌显著提高烟草植株的菌根侵染率、菌丝酶活性、总干重、Pn和WUE。无论接种CMV与否,AM真菌的菌根效应均为正值且存在菌种间的差异,以D.versiformis的菌根效应最为显著。可见,接种AM真菌对烟草抗CMV能力具有一定的促进作用,增加烟草植株的光合能力可能是AM真菌增强烟草植株抗CMV能力的主要作用机理。

中国小麦花叶病毒(CWMV)外壳蛋白(CP)特异性抗体的制备与应用

中国小麦花叶病毒(CWMV)是浙江省农业科学院发现并鉴定的一种土传病毒,其RNA2编码的外壳蛋白(CP)在病毒侵染过程中发挥重要功能。为了检测该蛋白表达并分析其生物学功能,该研究采用RT-PCR方法从感染CWMV小麦病叶中扩增获得CP基因,并通过In-Fusion技术构建了CWMV CP重组表达载体,将其导入BL21(DE3)菌株诱导表达;原核表达的重组CP蛋白经镍柱亲和层析纯化后注射免疫家兔,收集抗血清经亲和层析纯化获得CP多克隆抗体。Dot-ELISA、ID-ELISA、Western blot显示,该抗体不仅对CWMV具有高度的特异性,而且其效价高达1∶2.048×10^(7)、灵敏度达6.25×10^(-2)ng。应用该抗体采用Dot-ELISA、Western blot方法检测田间小麦样品显示其可用于CWMV的准确诊断,这为CWMV病毒病检测、CP定量分析及其功能研究奠定了基础。

西番莲中夜来香花叶病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus, TeMV)是对西番莲危害较大的一种病毒病原。根据病毒末端结合蛋白(VPg)序列设计引物,建立了以Vpg-334F/506R为特异性引物,退火温度54℃,引物浓度0.6μmol/L的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法可特异性扩增TeMV基因组6 483~6 675 nt区域,所得标准曲线扩增效率为10^(2).77%,决定系数为0.996 1,最低检测浓度为2.370×10^(2)拷贝/μL,灵敏度是普通PCR的1 000倍。应用该方法对接种TeMV的西番莲进行检测,发现接种3 d后可在叶片中检测到TeMV,定量分析不同温度下TeMV在叶片中的积累,发现26~28℃下病毒积累速度最快,且植株症状表现与病毒积累量密切相关。对赣南地区采集的76份西番莲田间样品进行检测,共检出71份阳性样品,检出率为93.4%。综上,本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强,灵敏度高,适于TeMV的快速检测。

斯里兰卡木薯花叶病毒AC2与拟南芥SGS3蛋白互作研究

木薯花叶病毒病(cassava mosaic disease,CMD)对我国和世界木薯生产造成严重威胁和危害,目前尚无有效防治方法且缺乏抗性材料,造成严重经济损失,被认为是最有威胁性的病毒病之一,斯里兰卡木薯花叶病毒(Sri Lankan cassava mosaic virus,SLCMV)是引起木薯花叶病的主要病原之一。RNA沉默是植物和动物先天性的一种抗病毒免疫反应机制,寄主转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)是真核生物中一种保守的基因表达调控机制,也是重要的抗病毒免疫机制之一。寄主基因沉默抑制子(suppressor of gene silencing 3,SGS3)是PTGS通路的关键蛋白,在寄主抵御病毒侵染中发挥着关键作用。为抵御宿主这种免疫反应,病毒通常编码病毒沉默抑制子(viral suppressors of RNA silencing,VSRs)来抵御寄主PTGS的病毒防御机制,与寄主蛋白互作是沉默抑制子发挥作用的主要作用机制之一。为探究SLCMV AC2是否通过与AtSGS3互作而抑制寄主PTGS的免疫功能,本研究采用酵母双杂交技术(yeast two hybrid system,Y2H)和双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)分析SLCMV AC2与AtSGS3之间的相互作用。结果表明:SLCMV AC2与AtSGS3蛋白在酵母细胞和植物体内均存在相互作用的关系。亚细胞共定位研究进一步证明SLCMV AC2在与AtSGS3互作后,可与AtSGS3形成siRNA-body的RDR6发生共定位。这些结果表明SLCMV AC2可能通过与siRNA-body互作而影响寄主自身免疫机制,提高病毒致病性,SLCMV AC2与AtSGS3的互作可能是SLCMV侵染木薯导致花叶症状发生的分子基础。该研究结果为后续深入解析SLCMV致病机理提供新的理论依据。

黄瓜花叶病毒侵染对丹参根系生长及生理特性的影响

为探讨丹参对黄瓜花叶病毒(CMV)侵染的生理响应机制,采用人工注射接种方法,设置注射接种CMV的丹参(CMV组)、仅空载体pCB301注射接种的丹参(MOCK组)以及未接种CMV的丹参(CK组)3个处理,比较分析接种CMV前后丹参苗根系生长、植株各部位代谢产物和生理特性的差异。结果表明,CMV侵染能够抑制丹参植株和根系的生长,破坏其内部代谢平衡。与MOCK组相比,CMV组侵染丹参的根长、须根数等各项根系指标均下降,根、茎和叶的可溶性蛋白、游离脂肪酸、总酸、总酚含量上升,总黄酮和可溶性糖含量则有所下降。与MOCK组相比,CMV组侵染丹参的丹酚酸类成分含量升高幅度最高可达35.12%,而丹参酮类成分含量降低幅度最高可达96.65%。CMV组侵染丹参根、茎、叶中的丙二醛(MDA)和过氧化氢(H_(2)O_(2))含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均明显高于MOCK组,最高分别上升78.53%、57.09%、58.95%、38.51%和58.86%。综上,为维持自身稳态,CMV侵染丹参植株生理指标发生明显变化,其中可溶性蛋白、MDA和H_(2)O_(2)含量及SOD和POD活性对CMV侵染的反应较为强烈,可作为丹参抗CMV评价的生理指标。本研究结果为丹参与植物病毒互作机制研究及相关抗病育种工作提供了理论依据。

基于CP基因的云南烟草花叶病毒RT-LAMP快速检测体系的构建

为快速检测云南烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),本研究根据来自云南烟草TMV分离物的外壳蛋白(CP)基因保守核苷酸序列,设计了5组引物进行筛选,并采用单一变量法对反应的温度、时间、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度及内、外引物浓度比等进行逐一优化,建立了云南烟草TMV逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系。结果表明,最佳引物组为第4组,最适反应温度为60℃,甜菜碱、dNTPs、Mg^(2+)的最佳反应浓度分别为0.6、0.4、2.0 mmol/L,最佳内、外引物浓度比为4∶1,最佳反应时间40 min。优化后的RT-LAMP经SYBR Green I染色可肉眼判断结果,特异性高,灵敏度是常规RT-PCR的10倍。RT-LAMP检测体系的建立为云南烟草TMV的检测提供了一种便捷、高效、可靠的方法。