花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子在转基因棉花中的表达

利用GUS作为报告基因 ,通过GUS组织化学定位法检测棉花转化愈伤组织、体细胞胚 ,R0 代棉花根、茎、叶、花器官以及正在发育的胚GUS基因表达情况 ,详细阐述了CaMV 3 5S启动子在棉花细胞中的表达轮廓。结果表明 ,在愈伤组织细胞有丝分裂和增殖过程中GUS基因能稳定表达并遗传给后代细胞 ;在根、茎、叶细胞中检测到GUS表达活性。在胚胎发育过程中 ,最早检测到GUS表达活性的为开花 1 1d的鱼雷胚和胚乳。随着胚胎的发育 ,GUS表达活性逐渐增强并扩展到子叶微管组织 ,表明CaMV 3 5S启动子是随着胚胎发育进程被逐渐调节的。在花粉和特殊的纤维细胞中 ,也检测到GUS的表达活性。资料证明 ,该启动子在棉花不同发育时期的大部分组织和细胞中都是表达的。

高灵敏度电化学发光PCR方法检测花椰菜花叶病毒35 S启动子

大多数转基因植物中使用花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus,CaMV)35 S作为启动子,因此可通过检测该启动子来判断植物样品中是否含有转基因成分。实验将高灵敏度电化学发光PCR方法用于检测转基因烟草中的CaMV35 S启动子,将该启动子的PCR产物与生物素标记的探针杂交,可以起到特异性筛选产物的作用;与发光标记物——三联吡啶钌标记的探针杂交,从而实现电化学发光检测。两种探针同时与待测样品的PCR产物进行杂交,进一步对样品进行特异性筛选,从而提高了检测的准确性,避免了假阳性结果的产生。实验结果表明:该法可以准确的区分待测样品中是否含有35 S启动子,从而区别转基因烟草和非转基因烟草。电化学发光PCR方法灵敏度高,可靠性强,操作简便,结果准确,有望成为一种高效的转基因植物检测方法。

电化学DNA传感器制备及用于花椰菜花叶病毒35S启动子快速检测

[目的]构建一种新型DNA电化学传感器,并用于花椰菜花叶病毒35S启动子片段检测。[方法]通过使用氨基化多壁碳纳米管对玻碳电极进行修饰,利用氨基化多壁碳纳米管对硫堇-金纳米粒子-DNA纳米复合物的吸附固定得到用于识别目标DNA的捕获界面,并将亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子作为结构末端的信号分子,完成夹心结构传感器组装。试验采用循环伏安法对辣根过氧化物酶催化过氧化氢得到的还原电流进行测试。[结果]该传感器可实现对目标DNA定量检测,线性范围为1×10-18~1×10^(-11)mol/L,检测限低至6.95×10^(-20)mol/L,可特异性识别错配序列,并且表现出良好的重现性和稳定性。[结论]该传感器在转基因食品的检测方面有良好的应用前景。

从带烟草花叶病毒外壳蛋白亚基因组启动子的负链RNA产生正链RNA

克隆了能在植物中表达白喉毒素Ａ链基因（ＤＴＡ）负链ＲＮＡ的基因ＴＣＤＴＡＮ。这个基因的读码框５’端上游带有ＴＭＶ外壳蛋白基因５＇端上游６３１个碱基。它的ＤＮＡ和ＴＭＶ－ＲＮＡ共转化烟草原生质体后，能抑制同时导入原生质体的ＣＡＴ基因的表达。ＣＡＴ基因表达的抑制，是ＴＣＤＴＡＮ基因产生白喉毒素Ａ链蛋白的结果。ＴＣＤＴＡＮ基因上ＴＭＶ外壳蛋白基因５’端上游片段，是产生白喉毒素Ａ链ｍＲＮＡ的必要条件。只有用多量产负链ＤＴＡＲＮＡ的质粒ＤＮＡ和ＣＡＴ基因同时转化时，原生质体的ＣＡＴ基因蛋白水平的表达才会受到明显的抑制。在用ＴＭＶ接种的试验中发现，用表达在读码框５’端上游带ＴＭＶ外壳蛋白基因５’端上游６３１个碱基ＣＡＴ负链ＲＮＡ的ＴＣＣＡＴＮ基因转化得到的烟株，测不出ＣＡＴ活性；用ＴＣＤＴＡＮ基因转化得到的烟株，也不能抗ＴＭＶ感染。

侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及RT-PCR扩增外壳蛋白基因研究

从杭州市郊区及本校附近菜园地表现严重花叶症状的花椰菜上分离到一种线状病毒，接种６科３１种鉴别寄主，能侵染５科２２种植物。病组织超薄切片可见风轮状内含体和片层聚集状内含体。感病的芥菜叶片，用０．５ｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液（ｐＨ７．５）匀浆后汁液加４％ＰＥＧ－８０００沉淀３ｈ，５％～４０％甘油梯度离心纯化病毒，可获得较高的产量。提纯的病毒均为一弯曲的线状颗粒，长度７４０ｎｍ左右。病毒提纯液于２６４ｎｍ处有一吸收峰，为典型的核蛋白紫外吸收。ＴｕＭＶ－Ｈ分离株抗血清包被的铜网能大量吸附病毒颗粒。用特异的ＰＣＲ引物扩增其外壳蛋白基因，可得－０．９Ｋｂ的片段。

花椰菜花叶病毒(新疆分离物)基因组DNA的全部核苷酸序列

用Maxam-Gilbert化学切断法,从含全长病毒DNA的克隆pCaMV C17中,测定了CaMV-XJ基因组的全部核苷酸序列。CaMV-XJ DNA含有8,060个碱基对。在不同的译读相位中,CaMV基因组含有6个主要ORF或可能的基因,与其他巳作全序列测定的三个CaMV分离物比较,有三个显著的差别;(1)ORFⅥ编码的氨基酸变化达16％,显著高于其他区域的变化和其他三个分离物之间的差别,(2)在ORFⅣ的近氨基末端有39bp的插入,它与被插入区的序列几乎是直接重复;(3)由于核苷酸置换而引入了终止信号,所以T.Hohn[2]推测,可能存在的ORFⅦ不可能编码有功能的蛋白。

花椰菜花叶病毒(CaMV)的基因表达调控

花椰菜花叶病毒（CaMV）是一种具有重要经济价值和生物学意义的植物双链DNA病毒，它有7个开放阅读框（ORF），其中6个呆各自编码一种蛋白产物。35S启动子区域含有3个转录因子专一的结合位点；RNA多腺苷化位点具有AAUAAA特征序列，它和其上游序列对35SRNA的加工和翻译有影响作用；下游ORFI在转录激活因子存在时可被翻译。由此表明，CaMV的表达调控表现在不同调控机制工作的基础之上。

新疆花椰菜花叶病毒的研究

从血清学、内含体、病毒形态及理化性质等方面,确证了自新疆十字花科蔬菜上分离到的63-3毒源（称为新疆分离物）是属于含 DNA 的花椰菜花叶病毒。新疆分离物与已知为花椰菜花叶病毒的 Campbell 毒株的抗血清发生沉淀反应。对感染了新疆分离物的油菜叶片超薄切片进行电镜观察,发现有多种内含体存在,其中直径15—18毫微米的小颗粒呈晶格排列。此情况,在花椰菜花叶病毒组（Caulimovirus）中尚未发现。新疆分离物纯化制剂的病毒颗粒为直径50毫微米的球状颗粒。病毒沉降系数 s20,w为200—220S,用二苯胺方法测定出病毒中 DNA 含量为16—18%,其侵染性能为 DNase 所破坏。这些特性都与国外报道的花椰菜花叶病毒的理化性质相一致。根据传毒媒介和在蔓陀萝上形成枯斑反应,新疆分离物可能是类似于 New York 8153这一类的一个毒株。

花椰菜花叶病毒及其作为载体的应用

除了Ti质粒以外,植物DNA病毒也是潜在的植物基因工程载体,目前已发现的植物DNA病毒仅十几个,分属子花椰菜花叶病毒组(Caulimovirus)和双联体病毒组(Geminiv irus)花椰菜花叶病毒组由于其DNA为双链,可直接从纯化的病毒粒子中得到,更为分子生物学家所关注。对该组病毒的代表——花梆菜叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus CaMV)的病毒学,生理学已有了较深入的研究,近十几年来对其遗传背景研究也有了引人注目的进展。Hohn小组成功地以该病毒为载体,克隆了256bP的二氢叶酸还原酶基因,并在植物中表达成功。CaMV还为植物基因工程提供了强的启动子。

花椰菜花叶病毒——一个很有希望的植物基因载体

植物基因工程的兴起,使寻找适当的外来基因载体成了一个很迫切的问题。除了Ti质粒外,植物病毒的基因也能很好地在植物体内表达,有可能成为一种很好的基因载体。从七十年代末起,有一些植物病毒学家开始注意花椰菜花叶病毒(CaMV),这是因为:1.该病毒的基因组是一个比较小的双链DNA(约8000bP),便于体外操作;2.克隆的病毒DNA可以通过摩擦接种侵染植物。

人类可以从植物病毒研究中获取灵感花椰菜花叶病毒与成艾滋病病毒致病机理相同

美国普渡大学研究人员发现，常见的花椰菜花叶病毒（CaMV）和造成艾滋病的HIV病毒，用同样的过程在其寄生的细胞内繁衍、扩散疾病。人类应该能够从植物病毒研究中获取灵感，使HIV病毒停止复制。

番茄Tm-2^2基因在烟草中的表达及其对番茄花叶病毒（TOMV）的特异抗性

Tm-22基因在烟草上的转化和表达表明,Tm-22基因在同科不同属植物体上的功能没有改变。在两种类型的纯合转化体上,Tm-22基因编码蛋白能够抗Tobamovirus属5种不同的毒株,并能被ToMV-2a毒株感染而失去抗病性。这个结果表明:移动蛋白上的氨基酸变异能够影响R蛋白对ToMV的应答反应。Tm-22基因转化体在不同启动子的调控下,对ToMV-2a毒株感染所表现的症状不同,说明启动子在Tm-22基因的抗病反应中具有非常重要的作用。

核酸分子“光开关”作探针荧光光谱法检测转基因启动子病毒DNA特定序列

合成核酸分子"光开关"Ru(phen2)(dppx)2+,并以其作为荧光探针检测转基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35S)序列片段(5’-CATCGTT GAAGA TGCCTCTGCC G-3’).通过对检测条件的优化,测定CaMV 35S病毒DNA的线性范围为1.4×10-9～6.9×10-8 mol.L-1,线性关系:ΔI=1.6913C+5.5783(式中ΔI为标准溶液的荧光强度与空白溶液的荧光强度之差),R2=0.9938,检出限为8.6×10-10 mol/L.实验表明该方法有操作简单、灵敏度高和选择性好等特点,同时可以较好地识别碱基错配序列和非互补序列ssDNA.

花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子LAMP检测方法的建立

针对花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的保守序列设计特异性引物,并进行条件优化,建立CaMV35S启动子的LAMP检测方法。该方法具有良好的特异性,检测灵敏度可达0.002%。对80份各类植物及其加工品进行检测,检测结果与实时荧光PCR法完全相符。CaMV35S启动子的LAMP检测方法,在检验检疫行业和食品加工业具有广阔的应用前景,对于加强转基因产品检测监管,促进进出口贸易具有重要意义。

CBF1转录因子基因的克隆及两种启动子调控下的植物表达载体的构建

CBF1转录激活因子能调控一组抗干旱、抗低温基因的表达,更有效地提高植物抗干旱、抗低温的能力。现在国内外许多研究机构已经利用导入该转录因子来提高植物的抗寒性、抗旱性,并且获得一定的成功,但在园林植物上的应用还有待探讨。因此,本研究以拟南芥叶片为材料,通过PCR方法对其基因组DNA扩增,成功地克隆了逆境诱导型启动子和CBF1转录因子并分别构建了花椰菜花叶病毒CaMV35s启动子和rd29a启动子调控下的CBF1融合基因表达载体,为下一步转化园林植物,利用CBF1基因综合改良园林植物抗逆性及进一步探讨CBF1基因的抗逆分子机理奠定了物质基础。

江西铅山红芽芋芋病毒种类lncRNA测序鉴定及其序列分析

探究江西铅山红芽芋的主要病毒种类及其序列信息,为其脱毒苗培育提供依据。采用lncRNA测序技术确定江西铅山红芽芋的病毒种类,并利用RT-PCR技术、生物信息学分析软件和qRT-PCR技术进行病毒验证、序列分析和组织表达分析。江西铅山红芽芋检测到芋花叶病毒(DsMV)和花椰菜花叶病毒(CaMV)两种病毒;DsMV和CaMV基因cDNA总长度分别为1780 bp和5412 bp,分别编码592和1803个氨基酸;DsMV和CaMV多聚蛋白二级结构均由α螺旋、β-片层、无规则卷曲构成,其三级结构均为单体蛋白;DsMV和CaMV在江西铅山红芽芋根、茎、叶中均有侵染,但均在叶中表达量最高。明确了侵染江西铅山红芽芋的主要病毒种类,并首次在江西铅山红芽芋上检测到CaMV。

转基因油菜中核酶介导的对花椰菜花叶病毒的高度抗病性

设计了特异切割花椰菜花叶病毒(CaMV,ds DNA病毒)35S RNA的锤头型核酶基因(Rz);同时将核酶保守区内的一个G碱基以U代替构成核酶突变体(mRz)作为对照.体外切割实验表明.Rz可按设计要求高效特异地切割355 RNA,而mRz则完全没有切割活性.将Rz和mRz克隆到pROK2构建成植物表达载体pROK2-Rz和pROK2-mRz.采用转化下胚轴法转化油菜,通过筛选获得转Rz和mRz基因油菜植株、攻毒实验证明Rz当代转化植株表现出对CaMV的高度抗病性,75%的植株不表现任何症状,也测不出CaMV的存在,其抗病植株的T_1后代的抗病性按孟德尔定律3:1分离.mRz当代转化植株及其T_1后代植株只具有极其微弱的减轻症状的作用.

肯尼亚科学家通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得抗香蕉条斑病毒的香蕉品系

香蕉(Musa spp.)是世界上重要的经济作物之一,广泛种植于世界各地的热带和亚热带地区。香蕉条斑病毒(Banana streak virus, BSV)是侵染香蕉的重要病原物之一,是副反转录病毒(Pararetrovirus),属花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)杆状DNA病毒属(Badnavirus)。

中晚熟花椰菜品种“津雪88”

“津雪88”是天津市科润公司蔬菜研究所育成的花椰菜一代杂种．属春秋两用型品种。株高80-85厘米．株幅75—80厘米，株型紧凑，适合密植。叶片灰绿色，蜡粉多，叶片向内抱合护球，花球雪白、极紧实，球型呈半圆型。维生素C含量为64-3毫克／100克鲜重。抗芜菁花叶病毒病．兼抗黑腐病。春季栽培成熟期45—50天，为极早熟品种。平均单球重1．2千克，亩产达3000千克。

多重荧光PCR同时检测转基因成分35S和Nos方法的建立

根据商品化转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子 (Nos)的序列特点 ,设计并合成了两对引物和相对应的荧光双链探针 ,建立一种应用荧光双链探针的多重荧光PCR同时检测转基因成分 35S启动子和Nos终止子的方法 .并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等 11份实物样品进行了检测 ,其中有 5份样品结果阳性 .结果表明所建立的多重荧光PCR方法能同时检测出 35S和Nos双组分 ,较常规PCR技术更为简便、快速、准确 ,有很好的应用前景 .