M-sol血小板保存液中添加花生四烯乙醇胺对体外保存血小板的影响

本研究探讨在M-sol(mixture of solutions)血小板保存液中添加花生四烯乙醇胺(N-arachidonoylethanolamine,ANA)对体外保存血小板的影响。利用Amicus血细胞分离机采集无偿献血志愿者的血小板,血小板保养液为M-sol,实验组加入终浓度为0.1-50μmol/L的ANA,未加入ANA的另一组作为对照,置于22±2℃振荡仪中保存。于第7 d取样,用MTT比色法分析血小板的存活率。选定最佳浓度的ANA加入血小板保存液中,分别于第1、5、7、9和11 d取样,检测血小板计数(BPC)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板磷脂酰丝氨酸(PS)膜外表达以及可溶性P-选择素(sP-selectin)含量。结果发现,加入终浓度为0.5μmol/L ANA的血小板存活率(91.23±5.44%)最高,与对照组(62.54±4.79%)相比,差异具有统计学意义(P<0.05);保存第1、5、7、9和11 d实验组与对照组BPC均有下降趋势,但两组相比差较异均无统计学意义(P均>0.05);保存期间血小板MPV和PDW有增加趋势,实验组与对照组相比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。保存到第9和11 d血小板膜外PS的表达,在实验组PS表达阳性率显著低于对照组(7.69±1.82%vs 11.21±2.03%;10.74±1.78%vs15.37±1.95%),两组相比较差异具有统计学意义(P均<0.05);保存期间可溶性P-选择素含量在两组中均有增加趋势,实验组可溶性P-选择素含量显著低于对照组(30.19±2.03 ng/mL vs 39.18±2.66 ng/mL;34.52±2.64ng/mL vs 43.23±2.58 ng/mL),两组相比差较异具有统计学意义(P均<0.05)。结论:将低浓度ANA加入血小板M-sol保存液中,在一定程度上可以减轻血小板贮存损伤。

花生四烯乙醇胺对血小板线粒体细胞色素C的释放和细胞凋亡的影响

目的探讨花生四烯乙醇胺(ANA)对血小板线粒体细胞色素C(Cyt-C)的释放和细胞凋亡的影响。方法将从无偿献血者中采集的血小板,分为实验组(n=20):加入终浓度为0.5μmol/L的ANA;对照组(n=20):未加ANA;2组均置于(22±2)℃水平振荡的振荡仪保存7 d。Western blot检测血小板线粒体Cyt-C的释放和caspase-3的表达、流式细胞仪检测血小板磷脂酰丝氨酸(PS)膜外表达,ELISA方法检测caspase-3的活性。结果实验组与对照组比较,PS表达阳性率:(8.29±1.44)%vs(14.24±2.47)%(P<0.05);caspase-3活性形式表达量:(0.063±0.014)%vs(0.132±0.025)%(P<0.05);caspase-3活性:0.096±0.04 vs 0.208±0.03(P<0.05);Cyt-C从线粒体释放到胞浆的数量比值:(3.18±1.32)%vs(15.13±3.40)%(P<0.05)。结论 ANA降低血板PS的膜外表达、减少线粒体Cyt-C的释放以及降低caspase-3活性,延缓了血小板凋亡。提示ANA可能通过抑制线粒体介导的途径抑制血小板凋亡。

花生四烯乙醇胺的研究进展

花生四烯乙醇胺 (arachidonoylethanolamide,anandamide ,ANA)是近年来确定的大麻素受体的内源性配基 ,它主要分布在中枢神经系统、免疫系统及子宫等部位 ,具有大麻的主要活性成分———Δ9 四氢大麻酚 (Δ9 THC)的药理功能 .ANA有两种受体 ,即脑型受体 (CB1)和脾型受体 (CB2 ) ,它们都是与GTP偶联的跨膜受体 ,是ANA发挥作用的主要途径 .脂肪酸酰胺水解酶 (fattyacidamidehydrolase,FAAH)是ANA特异性极高的水解酶 ,它可以迅速调节ANA在体内的含量 ,从而发挥特异的生理作用 .

蛋白激酶C参与内源性大麻素花生四烯乙醇胺对L型钙电流的抑制作用

目的研究内源性大麻素物质花生四烯乙醇胺是否通过改变蛋白激酶C(PKC)活性从而抑制心肌L型钙电流,并进一步探讨可能改变PKC活性的信号途径。方法应用全细胞膜片钳技术记录单个心肌细胞的L型钙电流(P<0.05);应用PepTag非放射性蛋白激酶C检测系统(Promega)检测PKC活性;Elisa试剂盒测定细胞中二脂酰甘油(DAG)的含量;western blot技术测定磷脂酶Cβ(PLCβ)和磷酸化磷脂酶Cβ(p-PLCβ)表达。结果应用花生四烯乙醇胺灌流心肌细胞后显著抑制心肌L型钙电流(P<0.05),预先应用大麻素1型受体(CB1)阻断剂AM251或PKC非特异性激动剂佛波醇酯(PMA)可以完全阻断此抑制效应,而大麻素2型受体(CB2)阻断剂AM630没有阻断花生四烯乙醇胺抑制L型钙电流的作用。检测心肌细胞PKC活性发现,花生四烯乙醇胺明显抑制PKC活性(P<0.05),同样预先应用AM251或PMA完全阻断花生四烯乙醇胺对PKC活性的抑制效应,而AM630无此效应。应用花生四烯乙醇胺没有影响心肌细胞DAG含量和PLCβ的磷酸化。结论本实验首次证明内源性大麻素花生四烯乙醇胺激活心肌细胞CB1受体后抑制细胞PKC的活性,从而抑制L型钙电流,此过程没有PLCβ-DAG途径参与。

花生四烯乙醇胺对大鼠心功能与心肌一氧化氮水平及一氧化氮合酶活性的影响

目的观察大麻素类物质花生四烯乙醇胺(anandam ide,Ana)对大鼠体外心脏左心室心肌中一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响。方法采用Langendorff方法观察Ana对大鼠体外心脏心率(HR)、冠脉流量(CF)、冠脉灌注压(CPP)、左室压最大上升速率(+dp/dtm ax)、左室压最大下降速率(-dp/dtm ax)、左室收缩峰压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)及左室发展压(LVDP)的影响;NO含量和NOS活性采用联苯胺荧光分光光度法测定。结果Ana可使体外心脏心率、CPP、+dp/dtm ax-、dp/dtm ax、LVSP、LVDP降低,使LVEDP升高,CF增加。选择性大麻素CB1受体拮抗药AM251(1μmol.L-1)可阻断Ana的部分心脏效应;另一选择性大麻素CB2受体拮抗药AM630(1μmol.L-1)对Ana的心脏效应无显著影响。NOS抑制药L-N-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)(100μmol.L-1)对Ana的心脏效应也无显著影响。Ana能增强原生型NOS(cNOS)活性,抑制诱生型NOS(iNOS)活性,促进心肌NO的释放。结论Ana使离体大鼠心肌收缩力降低,心率减慢,表现出负性肌力和负性频率作用;Ana可舒张冠脉,增加冠脉流量;大麻素CB2受体可能不参与Ana的这些心脏效应,内源性NO也可能不参与调节Ana的心脏效应;可能存在其他新的作用位点调节Ana的心脏效应。Ana调节心肌NOS同工酶活性,增加cNOS活性,降低iNOS活性,促进NO的释放,可能发挥心肌保护作用,在心肌缺血和高血压治疗中有潜在应用前景。

气相色谱质谱联用仪定量检测内源性大麻素花生四烯乙醇胺及2-花生四烯酸甘油在胆道恶性肿瘤中的表达规律

目的探讨两种主要的内源性大麻素花生四烯乙醇胺(AEA)及2-花生四烯酸甘油(2-AG)在胆道恶性肿瘤(BTC)患者体液及肿瘤组织中的表达规律。方法采集中山大学附属第一医院2013年12月至2014年9月收治的22例BTC患者及8例良性胆道疾病患者的外周血及胆汁,其中15例BTC患者同时收集癌巢组织及癌旁正常组织,利用氯仿/甲醇抽提法配合固相萃取,分离患者体液及组织样本中的脂质,以二甲基异丙基硅烷-咪唑对脂质进行硅烷化处理,气相色谱质谱联用仪测定AEA及2-AG的浓度。结果与良性胆道疾病患者相比,BTC患者血浆中2-AG显著升高[180.01(140.72~283.84)nmol/L vs 42.33(25.61~148.93)nmol/L,P<0.05],AEA浓度降低但差异无统计学意义;胆汁中AEA浓度显著降低[1.80(0.50~5.00)nmol/L vs 10.15(2.68~17.49)nmol/L,P<0.05],2-AG浓度升高但差异无统计学意义。BTC癌巢组织与癌旁正常组织相比,AEA浓度显著降低[22.01(16.55~53.61)pmol/g vs 58.68(25.36~68.97)pmol/g,P<0.05],2-AG显著升高[1.97(1.44~5.43)nmol/g vs 1.10(0.36~1.47)nmol/g,P<0.05]。结论本研究建立了在BTC中定量检测AEA和2-AG两种内源性大麻素浓度的有效方法,测定AEA及2-AG在BTC患者体液及肿瘤组织中的异常表达,可作为BTC的辅助诊断。

花生四烯乙醇胺对血小板相关凋亡蛋白的影响

目的在血站标准存储血小板条件下,探讨花生四烯乙醇胺(N-Arachidonoylethanolamine,ANA)对血小板细胞相关凋亡的影响。方法利用Amicus血细胞分离机从无偿献血志愿者采集血小板,向其中一组加入终浓度为0.5μmol/L的ANA为ANA组,未加入ANA的另一组作为对照组,置于(22±2)℃水平振荡的振荡仪保存7 d。采用流式细胞仪检测血小板磷脂酰丝氨酸(PS)膜外表达;ELISA检测可溶性P-选择素的释放,Western blot检测血小板caspase-3和caspase-9的表达以及免疫共沉淀分析BCL-XL和Bak蛋白相互作用。结果 ANA组PS表达阳性率显著低于对照组[(8.29±1.44)%vs.(14.24±2.47)%,P<0.05];ANA组可溶性P-选择素含量显著低于对照组[(75.08±6.35)ng/ml vs.(90.37±8.91)ng/ml,P<0.05];ANA组BCL-XL和Bak蛋白的结合量显著高于对照组,约为对照组的2.6倍(P<0.05);ANA组caspase-9活性形式的量占总量(包括caspase-9酶原形式和活性形式)的百分比显著低于对照组[(9.63±1.47)%vs.(23.24±2.47)%];ANA组caspase-3活性形式的量占总量(包括caspase-3酶原形式和活性形式)的百分比显著低于对照组[(6.3±1.4)%vs.(13.2±2.5)%],两组相比差异均具有统计学意义。结论 ANA促进BCL-XL和Bak蛋白的结合,抑制了caspase-3和caspase-9的活化,在一定程度上抑制血小板凋亡。

N-花生四烯酰乙醇胺及其类似物的神经保护作用

N-花生四烯酰乙醇胺(anandamide,AEA)属于内源性大麻素类长链脂肪酸衍生物,可通过大麻素受体(CB1/CB2)和(或)非CB1/CB2受体途径发挥神经保护作用。AEA类似物包括脂氨基酸类、脂肪酰乙醇胺类和甲基氟膦酸酯类化合物等。AEA类似物在生物活性及化学结构上与AEA相似,但作用靶点及作用机制并不完全相同,非CB1/CB2受体途径介导的神经保护活性及对脂肪酸酰胺水解酶活性的调节作用为该类化合物的重要特征。由于AEA作用于多靶点所致的许多副作用,给其临床试验和应用带来一定困难,而AEA类似物可能既具备AEA的神经保护活性又避免其毒副作用,因此研究AEA类似物的神经保护作用具有重要的理论意义和应用价值。本文主要对AEA及其类似物的神经保护活性和其作用机制进行综述。

室旁核内花生四烯酰乙醇胺对心衰大鼠的心脏功能和交感神经活动的影响

目的:探究慢性心衰大鼠下丘脑室旁核(PVN)内花生四烯酰乙醇胺(AEA)对心脏功能和交感神经活动的影响。方法:采用冠状动脉结扎法构建大鼠心衰模型,超声心动图检测心功能;PVN内连续4周分别灌注AEA、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)选择性抑制剂KN-93、瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)通道特异性阻断剂辣椒平(CPZ)、Ca^(2+)螯合剂BAPTA-AM和小电导钙激活钾通道(SK通道)阻断剂apamin后,检测交感驱动及心功能指标;同时采用不同浓度AEA孵育NG108细胞,荧光测定法检测细胞内钙离子浓度([Ca^(2+)]_i);Western blot检测CaMKII、SK_2及磷酸化TRPV1蛋白水平。结果:与假手术组相比,心衰组左心室舒张末期压(LVEDP)明显升高,左室压力最大上升、下降速率(±dp/dt_(max))和射血分数(EF)明显下降;PVN内AEA含量、[Ca^(2+)]_i及CaMKII、SK_2和磷酸化TRPV1蛋白水平均显著降低;与溶剂组相比,心衰组PVN内灌注AEA可显著降低心衰大鼠死亡率和交感驱动指标,并改善心功能;然而,PVN内分别灌注KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin均显著增强交感驱动指标并恶化心功能;AEA可剂量依赖性增加NG108细胞内[Ca^(2+)]_i及CaMKII、SK_2和磷酸化TRPV1蛋白水平。结论:室旁核内CaMKII/TRPV1/Ca^(2+)/SK_2信号通路可能参与了AEA对心衰大鼠心脏功能和交感神经活动的影响。

N-花生四烯基乙醇胺对背根神经节轴突再生的影响

背景:神经轴突再生主要受其自身再生能力和抑制性外环境的影响,N-花生四烯基乙醇胺在秀丽线虫中已被证实可以调控神经轴突再生,而在哺乳动物中的作用仍是未知。目的:探究N-花生四烯基乙醇胺对小鼠背根神经节神经元轴突再生的作用。方法:取6-8周龄ICR小鼠的L4-L5处背根神经节组织,经过胶原酶和胰酶消化后,分成脂肪酸酰胺水解酶选择性抑制剂URB597干预组、N-花生四烯基乙醇胺干预组、二甲亚砜对照组、电转绿色荧光蛋白与特异性脂肪酸酰胺水解酶siRNA混合物组。细胞经过3 d的体外培养后,通过神经元特异性抗体免疫标记轴突,测量轴突长度、初级分支和次级分支数量并对其进行统计,判断N-花生四烯基乙醇胺对背根神经节神经元轴突再生的调控作用。结果与结论:①抑制脂肪酸酰胺水解酶活性后,背根神经节细胞轴突再生没有明显的变化并且URB597对背根神经节神经元不具有细胞毒性作用(P>0.05);②敲减脂肪酸酰胺水解酶后,背根神经节细胞轴突再生没有明显的变化(P>0.05);③外源性N-花生四烯基乙醇胺对背根神经节细胞轴突再生没有明显的调控作用,并且N-花生四烯基乙醇胺,对背根神经节神经元细胞没有细胞毒性作用(P>0.05);④无论是抑制脂肪酸酰胺水解酶活性还是加入外源性N-花生四烯基乙醇胺,对背根神经节神经元轴突分支均没有影响(P>0.05)。

1992—2010年N-花生四烯酰乙醇胺研究文献计量分析

通过文献计量学方法分析内源性大麻素N-花生四烯酰乙醇胺(anandamide,AEA)的研究现状。以anandamide为关键词在ISI Web of Knowledge数据库中检索相关文献,对其发表时间、语种、作者、期刊来源、学科类别和被引用次数等进行分析。共检索相关文献3015篇,主要作者、国家、期刊、学科类别、发表时间依次为:Di Marzo V(220篇)、美国(1254篇)、Br J Pharmacol(189篇)、生物化学与分子生物学类(2631篇)、2009年(318篇)。AEA领域的研究正逐渐受到世界各国研究者的重视,但其产业化、规模化发展还需要很长的发展过程。

N-花生四烯甘氨酸(NAGly)缓解七氟烷诱导的发育期大鼠原代海马神经元神经毒性

目的探讨N-花生四烯酰乙醇胺(N-arachidonoylethanolamine,AEA)类似物N-花生四烯甘氨酸(Narachidonoyl glycine,NAGly)对发育期大鼠原代海马神经元七氟烷暴露诱导的神经毒性的保护作用。方法体外培养7 d的原代海马神经元经七氟烷暴露,同时给予NAGly处理,采用TUNEL染色和流式检测细胞凋亡。Western blot检测凋亡蛋白表达。结果 NAGly促进细胞活性,抑制了七氟烷诱导的凋亡。NAGly改善了七氟烷暴露诱导的ERK1/2活性抑制。MEK抑制剂能够破坏NAGly的神经保护作用。结论 AEA类似物NAGly能够保护发育期海马神经元改善七氟烷诱导的神经毒性,其可能机制是通过上调MEK/ERK1/2 MAPK信号通路实现的。

内源性大麻素—生物合成、信号转导及生物降解

大麻素系统由内源性大麻素、大麻素受体和内源性大麻素失活系统三部分组成,该系统失衡与多种中枢神经系统和免疫系统疾病有关。内源性大麻素水平是衡量大麻素系统活性的主要指标。内源性大麻素代谢途径的深入研究对揭示大麻素系统生理、病理作用以及设计基于该系统的新型治疗药物至关重要。该文综述内源性大麻素的生物合成、信号转导及其降解过程。

室旁核内脂肪酸酰胺水解酶上调介导慢性心衰大鼠交感神经兴奋亢进

目的:探讨慢性心衰大鼠室旁核(PVN)内脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)表达失衡导致中枢交感传出增加的机制。方法:雄性Wistar大鼠左冠状动脉结扎8周后,用超声心动图检测心功能,并通过组织病理学测定心肌梗死面积,鉴定大鼠心衰模型构建成功;酶联免疫吸附法测血浆去甲肾上腺素(NE)水平;Western blot测定PVN内FAAH蛋白表达量;高效液相色谱法测定PVN内N-花生四烯酰乙醇胺(AEA)的生成量;PVN微量注射AEA、FAAH抑制剂PF3845或r AAV2-FAAH sh RNA病毒,记录交感驱动和心功能指标的变化。结果:与假手术组相比,心衰组心功能显著降低,血浆NE显著增加,PVN内FAAH表达量显著上调,AEA生成量显著减少(P<0.05);PVN微量灌注PF3845、AEA或r AAV2-FAAH sh RNA病毒后,心衰组交感驱动指标显著降低,心功能明显改善。结论:心衰状态下PVN内FAAH蛋白表达上调可能引起AEA生成量的减少,从而增强交感神经兴奋性,恶化心衰。