重组质粒pHN32对花生根瘤菌固氮的影响

通过三亲本杂交将大豆根瘤菌高效基因工程菌株HN32所携带的增效重组质粒pHN32引入一株快生型花生根瘤菌菌株85-7和另一株慢生型花生根瘤菌菌株co2-5中。花生盆栽结瘤试验结果统计分析表明:p的HN32载体质粒pLAFR1对根瘤菌85-7和co2-5的固氮功能没有影响;pHN32对85-7固氮影响不论在植株干重方面还是在固氮酶活方面统计学上都不显著;而对co2-5则植株干重提高了25.7％,存在极显著差异,固氮酶活尽管提高了51.8％,但统计学上不显著。根瘤中分离的Tc^r根瘤co2-5(pHN32)中的pHN32EcoR1酶切分析表明:pHN32没有发生结构上的变化且固氮增强作用可能由3.7kb外源片段引起。

花生根瘤菌的抗逆性初步研究

对３９株花生根瘤菌（其中６株为引进菌株）和９株参比菌株进行干旱、ＮａＣｌ、ｐＨ及低温的耐受性实验。结果表明我国花生根瘤菌资源中存在着耐盐、酸较强的菌株，且耐受性水平差异较大；在８℃条件下供试菌株未见生长；花生根瘤菌有着比大豆根瘤菌更强的抗干旱能力，抗干旱能力同耐盐能力之间没有明显的关系。另外，菌株的抗逆性同共生特性、分离地之间也未见有明显的关系。

钼与花生根瘤菌的复配及在酸性紫色土上的接种效果

通过供试菌株Spr4-5、Spr2-9耐钼酸钠、钼酸铵试验表明,根瘤菌耐Mo能力强,耐钼酸铵能力比钼酸钠强,不同菌株耐钼能力不同。在研制的“高效根瘤菌+Mo”的复合菌肥中,用钼酸铵生产的复合菌肥比用钼酸钠的活菌数高,高活菌数持续的时间长;复合菌肥的pH一般随含钼量的增加和贮存时间的延长而升高,但复合钼酸铵菌肥pH增幅较小,复合钼酸钠菌肥pH增幅较大。在贮存的180d内,复合钼酸铵的菌肥活菌数和pH均符合《根瘤菌肥料》质量标准;钼酸钠对菌肥的活菌数和pH影响大,钼酸钠不宜作为钼肥添加到根瘤菌剂中。盆栽试验表明,不同菌株共生固氮的有效性与钼酸铵浓度相关。钼酸铵浓度为0.2%时,供试菌株Spr 4-5共生固氮效果最好,比CK增产73.4%,比传统菌肥增产13.7%,占瘤率为59.7%;钼酸铵浓度为0.3%时,Spr 2-9共生固氮效果最好,比CK增产49%,比传统菌肥增产21.4%,占瘤率为70.3%;其增产效果均达极显著水平。

江汉平原及其周边地区花生根瘤菌的遗传多样性

采用 RAPD分析技术和 1 6S- 2 3S r RNA间隔区段 (IGS) RFLP分析 ,分别对分离自江汉平原及其周缘地区的花生根瘤菌进行了遗传多样性和系统发育研究。结果表明 ,全部供试菌株分别在 48%和 50 %的相似性水平分为 I、II两群。供试花生根瘤菌与参比菌株 B. japonicum和 B. elkanii聚在群 I,参比菌株Rhizobium Sinorhizobium、Mesorhizobium和 Agrobacterium聚在群 。供试花生根瘤菌的遗传多样性及其在系统发育中的地位主要受地域因素的影响 ,来自江汉平原中心地带天门和潜江的菌株在 76%以上的相似性水平上聚在一起。处于周边地带的武汉和荆州 ,由于其特定的地理因素的影响 ,菌株的多样性更为丰富 ,部分菌株在分类上与其它地域的菌株相互融合 ,并在较高的相似水平存在一定摆动性。来自外缘随州的菌株 ,表现了明显的地理分隔作用 ,其在系统演化中的地位相对独立。总体上从平原腹地到外缘地区 ,根瘤菌地理分隔作用逐渐明显 ,在平原外缘的交接地带 ,根瘤菌的多样性最为丰富。

用rep-PCR技术研究中国花生根瘤菌的多样性

采用细菌基因组重复序列ＰＣＲ技术（简称ｒｅｐＰＣＲ）中常用的ＲＥＰＰＣＲ和ＥＲＩＣＰＣＲ，对从中国１１个省、市的２３个点、２４个花生品种采集的根瘤中分离的５９株花生根瘤菌Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．（Ａｒａｃｈｉｓ）进行多样性研究，同时对来自国外的６株花生根瘤菌及１４株参比慢生根瘤菌也进行了比较。得到的低相似性结果表明中国花生根瘤菌基因组存在显著的多样性。ＲＥＰＰＣＲ揭示，在相似性５０％上分为１１个群，而ＥＲＩＣＰＣＲ却得到２４个分群。这两种结果对菌株的分群有差异，暗示这两种短重复序列在慢生根瘤菌基因组中的分布的不同。没有发现菌株间基因组的多样性分布与花生品种、地理来源之间的必然联系。将两者电泳图谱结合并分析，得到介于上述两者间的结果。此结果进一步反映了菌株基因组间存在的多样性。同时还表明ｒｅｐＰＣＲ不仅是研究生物多样性的快速简便方法，还可应用于菌株的鉴别和生态学研究。

河北地区花生根瘤菌的系统发育多样性研究

【目的】了解中国北方地区花生根瘤菌的多样性状况。【方法】采用16SrDNAPCR-RFLP、16S～23SIGSPCR-RFLP和16SrRNA基因的序列分析方法对分离自河北地区的58株花生根瘤菌以及Rhizobium、Agrobacterium、Sinorhizobium、Mesorhizobium和Bradyrhizobium的参比菌株进行系统发育多样性比较分析。【结果】16SrDNAPCR-RFLP方法在细菌属水平上聚群良好;而16S～23SIGSPCR-RFLP则适于属和种水平上的聚群。3种方法在系统发育上得到基本一致的结果。其中有38株花生根瘤菌是与Bradyrhizobium关系密切的慢生菌株,并且与B.japonicum和B.liaoningense的关系最为接近,与有关中国西南地区和华中地区花生根瘤菌的报道结果相似。然而供试菌株中还存在6株快生和10株中慢生花生根瘤菌,其中快生菌在系统发育关系上接近R.yanglingense、R.mongolense和R.gallicum。【结论】河北地区的花生根瘤菌具有更大的多样性。

用发光酶基因(luxAB)标记法研究慢生花生根瘤菌的竞争结瘤能力

lux AB基因标记是一种新型基因标记技术 ,在很多研究领域都有着良好的应用前景。研究通过三亲本杂交将 lux AB基因成功地向慢生型花生根瘤菌进行了转移 ,并获得了一株带 Lux AB基因标记的菌株Cspr7- 1。对 Cspr7- 1进行性状、标记基因的遗传稳定性检测 ,结果表明 ,Lux AB基因不仅能有效表达 ,而且性状稳定。在无氮水培条件下进行标记菌株与土著根瘤菌的竞争结瘤试验。结果证实 ,Cspr7- 1在植物根系上的占瘤率平均达到 61 .3% ,比土著根瘤菌的竞争结瘤能力强 ,而且 Cspr7- 1在主根上的侵染能力远较侧根上的强 ,平均高出 2 2 .3%～ 39.6%。

用AFLP技术检测慢生型花生根瘤菌竞争结瘤的研究

以 5株慢生型花生根瘤菌和天府 3号花生为材料 ,用 AFLP技术研究了慢生型花生根瘤菌 Spr2 - 9、Spr3- 3、Spr3- 5、Spr4- 5和 Spr7- 1的遗传特性和竞争结瘤能力。结果显示 ,供试条件下 ,传代次数对菌株的遗传性状无明显影响 ,2 8℃培养条件下 ,花生根瘤菌连续传 96代 ,其 AFLP指纹未发生明显变化 ;37℃培养 ,仅 Spr3- 3和 Spr3- 5能够存活并正常生长 ,其 AFLP指纹也未发生明显改变 ,然而其它菌株不能生长。将供试慢生型花生根瘤菌分别接种天府 3号花生 ,光照培养 30 d后 ,随机各取 4个根瘤 ,从根瘤中提取类菌体 DNA进行 AFLP分析 ,各根瘤类菌体 DNA的 AFLP指纹图谱与该菌株纯培养物 AFLP指纹相同。将 5个菌株混合接种天府 3号花生 ,不同菌株的占瘤率存在差异 ,Spr3- 3和 Spr3- 5的竞争结瘤能力最强 ,两菌株的占瘤率之和为 85.4% ;Spr4- 5的占瘤率为 1 2 .2 % ;Spr7- 1为 2 .4% ;而 Spr2 - 9的竞争结瘤能力最差。本试验结果说明 ,AFLP技术用于根瘤菌生态和竞争结瘤能力研究 ,具有下列优点 :简易、快速、准确 ;直接取豆科植物的根瘤提取 DNA,进行原位研究 ;在不改变菌株遗传特性 ,即不使用突变株的前提下 。

金沙江干热河谷区土著花生根瘤菌耐旱性初步研究

在摸拟干旱条件下 ,对分离自金沙江干热河谷区 45株土著花生根瘤菌进行耐旱性鉴定分析 .结果显示 ,供试菌株耐旱能力呈现多样性特征 ,同时 ,这些供试菌株在模拟干旱条件下的生长模式表现出多样性特征 .图 4表 2参

花生根瘤菌在根瘤菌系统分类中的地位研究

用12株分类地位已知的代表菌为对照,采用现代细菌分类学方法,对从四川省4个花生产区的天府3号和地方品种上分离的花生根瘤菌,从系统发育方面,探索了花生根瘤菌在根瘤菌系统中的分类地位。多聚酶链反应(PCR)扩增的16S rRNA的4种限制性内切酶长度多态(PCR-RFLP)以及16S rRNA部分碱基序列测定结果同时表明:四川花生根瘤菌与慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)相似性极高。由此推论它们在系统发育及进化方向上是基本一致的。该结果为研究花生根瘤菌的确切分类地位打下了基础。

外源质粒（基因）导入花生根瘤菌的行为分析

利用二亲本或三亲本杂交的方法，将携带有共生固氮基因的外源重组质粒或外源载体质粒导入慢生型花生根瘤菌［Ｂｒａｄｙｒｈｚｏｂｉｕｍｓｐ．（Ａｒａｃｈｉｓ）］１４７－３和快生型花生根瘤菌［Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．（Ａｒａｃｈｉｓ）］８５－７中。探讨了转移接合子中外源质粒在人工培养条件下和共生条件下的稳定性，发现外源质粒在花生根瘤菌中的稳定性与质粒的类型、受体菌的特性和环境条件有关。同时还探讨了外源质粒上的共生基因对受体菌１４７－３共生固氮效率的影响。结果表明，外源共生基因对共生固氮能力的影响是复杂的，既可以产生正效应，也可以产生负效应。

花生根瘤菌的数值分类

从我国 １１个省、 １６种土壤类型、 ２０多个花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ Ｌ．）品种上分离到的花生根瘤菌［Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．（Ａｒａｃｈｉｓ）］中选取５０个代表菌株、并与从津巴布韦引进的４株花生根瘤菌及７株慢生根瘤菌常用的参比菌株共６１株菌进行了１２８项表型特征的测定。数值分类的结果表明，全部菌株在７５％水平上相聚，并在７６％和７７％的水平上分别聚成两大群（群Ⅰ、群Ⅱ），每大群以较高的相似性（８５％- ９４％）各聚成６个亚群。所用数值分类方法不能将花生根瘤菌和大豆根瘤菌在属的水平上分开，但亚群和未归入亚群的菌株可能暗示亚种或种存在，同时本文结果还表现出花生根瘤菌的地域分布差异及其多样性。

花生根瘤菌对微量元素耐性的筛选

在YMA平板上对18株分离自四川的慢生型花生根瘤菌进行Fe、Co、Zn、B、Mo、pH的耐性实验。结果表明,在柠檬酸铁、钼酸铵浓度为0.50%时供试菌株均能生长,当柠檬酸铁浓度增至1%时有22%的供试菌株能正常生长,当钼酸铵浓度增至0.6%时有11%的菌株能正常生长;在硼酸浓度为0.05%时所有菌株生长受抑制或不生长;在硫酸锌或硫酸钴浓度为0.025%时分别有50%或28%的菌株能正常生长,当浓度增至0.075%时,供试菌株不生长或61%的菌株不生长。表明供试菌株对Fe、Mo的耐性较强,而对Co、Zn、B的耐性较弱;不同根瘤菌株对同一微量元素的耐性差异较大,同一根瘤菌对不同微量元素的耐性差异也较大。多数菌株在pH 6.0-8.0范围内生长正常,耐碱能力比耐酸能力强。因此,在研制“根瘤菌＋微量元素”复配的根瘤菌剂时,微量元素不能随意复配,同时还需注意菌剂的pH。

花生根瘤菌群体遗传多样性和系统发育研究

利用 16SrRNARFLP、16SrRNA序列分析和 16S～ 2 3SIGSPCRRFLP技术对 4 3株花生根瘤菌和来自其他种属的 15个参比菌株进行了群体遗传多样性和系统分析。 16SrRNAPCRRFLP分析结果表明 ,所有供试花生根瘤菌均属于慢生根瘤菌属 ,在系统发育上与B .japonicum的亲缘关系最近 ,具有相同的 16SrRNARFLP基因型 ,而与B .elkanii相对较远。 16SrRNA序列分析结果表明 ,供试花生根瘤菌在系统发育上更接近于B .liaoningense ,序列间差异小于 1% ,而B .liaoningense在系统发育上与B .japonicum相距很近 ,其序列间差异小于 1%。 16S～ 2 3SrRNAIGSRFLP分析结果表明 ,尽管花生根瘤菌与B .japonicum和B .elkanii的亲缘关系很近 ,但在 71%的相似性水平上供试花生根瘤菌仍各自聚为一群 ,并可进一步分为A、B、C和D 4个亚群 ,该分群还明显反映了地理因素对群体遗传多样性和系统发育的影响。

慢生型花生根瘤菌16S rRNA分析

以２１株分离自四川、云南不同花生产区的慢生型花生根瘤菌和６株参比菌株为材料，进行了１６ＳｒＤＮＡＰＣＲＲＦＬＰ，结果除证实了慢生型花生根瘤菌同慢生型大豆根瘤菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）高度的遗传相似性外，还发现一些菌株同Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｉａｏｎｉｎｇｅｎｓｉｓ和Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｌｋａｎｉ有较高的遗传相似性，菌株Ｓｐｒ１２的１６ＳｒＲＮＡ部分碱基序列同Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｌｋａｎｉ模式菌株ＵＳＤＡ７６的部分序列完全一样，从而证明我国的花生根瘤菌之间具有种水平的多样性．

GUS基因标记法对慢生花生根瘤菌竞争结瘤和接种效果的研究

应用GUS基因标记技术,可简便、快速、准确、原位、直观地确定标记花生根瘤菌株形成的根瘤,从而方便地研究标记菌株与土著根瘤菌的竞争结瘤能力。无氮水培试验表明,标记菌株gusA4-5、gusA2-9分别与土著菌混和接种占瘤率为71.4%、77.0%。盆栽试验表明,接种供试菌株Spr4-5、Spr2-9占瘤率分别为57.9%、63.0%,比对照极显著增产52.5%、22.7%;接种Spr4-5比Spr2-9极显著增产24.2%。初步说明两个供试菌株的竞争结瘤力比土著根瘤菌强,菌株Spr2-9强于Spr4-5;Spr4-5比Spr2-9有效性高,是结瘤适量,竞争结瘤能力强的高效菌株。

花生根瘤菌高效菌株的筛选及固氮效应的研究 Ⅱ.花生根瘤菌高效菌株的筛选及固氮效应田间试验

通过对花生根瘤菌的采集、菌株的分离和纯化以及对原寄主品种的回接等盆栽试验,已经筛选出优良菌株及菌种与寄主之间的最佳组合,达到人工接种增产的目的。为验证优良菌株的增产稳定性,我们连续进行了盆栽试验与田间试验。结果表明,优选菌株具有一定的稳定性,盆栽试验与田间试验具有增产一致性。而且3种优良菌株中两种或两种以上组合接种效果更佳,这为引进优良菌种、组合接菌提供了理论依据。

慢生花生根瘤菌的遗传多样性研究(英文)

用ＲＥＰ１Ｒ１和ＲＥＰ２１ＤＮＡ为引物，对２２株四川土著慢生花生根瘤菌染色体ＤＮＡ的基因外回文重复序列（ＲｅｐｅｔｉｔｉｖｅＥｘｔｒｏｇｅｎｉｃｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅＲＥＰ）进行了ＰＣＲ扩增和凝胶电泳，并对电泳结果的指纹图型进行了相似性聚类分析．结果表明了四川土著慢生花生根瘤菌的遗传多样性．

Mo与花生根瘤菌的复合菌剂对盛花期花生生长的影响

通过盆栽试验分析了"Mo+花生根瘤菌Spr2-9"复合菌剂对花生盛花期生长的影响。结果表明:(1)单接种Spr2-9(R1)能明显或显著增加植株干重、叶绿素和全氮量,分别比相应对照增加10.0%,14.6%,37.0%。(2)复合菌剂处理(R2,R3,R4)的占瘤率随钼浓度增大而增大,平均单瘤重随钼浓度增大显著降低,而总瘤数、全氮、叶绿素含量、植株干重随钼浓度的变化不显著。(3)钼能显著促进盛花期无菌处理(2,3,4)植株和根瘤的生长,平均单瘤重、叶绿素含量、植株干重、全氮量等随钼浓度增大显著增高,但对总根瘤数的影响不大。(4)等钼量的复合菌剂和无菌处理间,除无菌处理的单瘤重显著或明显高于复合菌剂外,其它都是复合菌剂处理高于无菌处理。表明供试根瘤菌是高效菌株,"Mo+供试根瘤菌"的复合菌剂对竞争结瘤、根瘤及植株生长有明显作用。

1株高效花生根瘤菌的筛选与鉴定

从辽宁多地花生种植土壤及其鲜根瘤初步筛选到30株花生根瘤菌,进一步通过回接盆栽花生,测定花生根瘤数、根瘤干重,以及鲜根瘤固氮酶活性、植株全氮量等,筛选出1株结瘤固氮能力较强花生根瘤菌wz-6,通过16S rDNA序列分析,鉴定为圆明慢生根瘤菌(Bradyrhizobium yuanmingense)。为开发优质花生根瘤菌菌剂奠定基础。