花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全c DNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与p MD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21(DE3)宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 k D,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。

酪蛋白糖巨肽对花生过敏原免疫反应性的影响

目的 探究酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptides,CGMP)与花生过敏原相互作用并降低其免疫反应性的潜力。方法 通过蛋白-蛋白分子对接技术探讨CGMP与Ara h1、Ara h2是否有相互作用的潜力。进一步通过混合水浴加热制备CGMP与花生蛋白的混合溶液(mixed solution of casein glycomacropeptides and peanut proteins,MCGP),建立MCGP致敏、花生蛋白激发的BALB/c小鼠模型,研究MCGP对花生过敏反应的影响。最后使用圆二色谱法研究酪蛋白糖巨肽与Ara h1、Ara h2的相互作用力及对其结构的影响。结果 CGMP与Ara h1、Ara h2间存在次级键(盐桥、氢键、范德华力),部分作用于过敏原表位;与花生蛋白过敏组相比, MCGP致敏组血清中的花生蛋白特异性免疫球蛋白E (specific immunoglobulin E, sIgE)、sIgG1、sIgG2a含量显著下降,白介素-4 (interleukin-4, IL-4)、IL-5、组胺水平显著下降,转化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)、γ干扰素(interferon-gamma, IFN-γ)水平显著升高, MCGP中Ara h2的α-螺旋与β-折叠的比例改变。结论 CGMP能够改变Ara h2的结构,遮蔽花生过敏原表位,抑制sIgE、sIgG结合Ara h1、Ara h2,降低部分花生过敏原的免疫反应性。

花生过敏原蛋白Ara h2的分离纯化研究

食物过敏是食品安全领域内比较突出的问题,花生因其高致敏性被列为八大致敏原之首。在花生致敏原中,Ara h2是主要致敏原。以Ara h2为研究对象,通过对花生脱脂,设置不同浸提液、pH、料液比、浸提时间的蛋白质浸提条件,透析分离纯化目标蛋白质,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对优化结果进行鉴定,正交试验确定最佳浸提工艺。结果表明:最佳浸提工艺参数为浸提时间90min、浸提pH值7.4、浸提料液比1∶8、浸提液Tris-HCl缓冲液。在此优化条件下目标蛋白质含量可达1.58mg·mL^(-1),浸提率可达47.8%。

DNA提取方法对实时荧光定量PCR检测花生过敏原Ara h 2基因的比较研究

食物过敏是一个世界性的公共卫生问题,其中花生过敏最为严重。基于DNA的分子生物学检测方法目前已广泛应用于花生过敏原检测,样品DNA的提取质量会显著影响检测的灵敏度及准确率。本研究比较了5种DNA提取方法,包括十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)法、柱式法及3种基于磁珠纯化技术的DNA快速提取法,对生花生、煮花生、炸花生、烤花生、花生酥和花生酱6种不同加工方式的花生基质样品进行DNA提取,考察了不同方法获得的DNA浓度、纯度指标,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)对花生过敏原Ara h 2基因进行了检测分析。结果表明,月桂酰肌氨酸钠(Sodium Lauroyl Sarcosine)磁珠法的适用性广、提取率高,对于6种花生基质提取的DNA均能高效检出花生过敏原Ara h 2基因;对于花生质量分数为0.05%~1.00%的小麦粉二元混合物,SLS磁珠法的DNA提取率总体优于CTAB法,并且能有效提取出与花生共用1条生产线的燕麦片中污染的花生DNA,证实SLS磁珠法提取的实际样品DNA能够满足花生过敏原检测目的。本研究为花生及其制品DNA提取方法提供了参考,特别是磁珠类方法,高效快速,提取质量能够保障后续基于DNA的花生过敏原分子生物学方法检测结果的准确性。

花生过敏原Ara h 1蛋白的原核表达及致敏性分析

从花生中提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应得到花生过敏原Ara h 1基因,构建pET-28a-Ara h 1表达载体,转入Rosetta(DE3)宿主表达菌中诱导产物表达,用镍离子亲和层析法纯化得到目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示目的蛋白分子质量约为75 kDa,与预计相符;经质谱鉴定为Ara h 1蛋白。用BALB/c小鼠模型评价重组Ara h 1蛋白的致敏性结果显示,重组Ara h 1蛋白致敏小鼠血清中特异性抗体、Th2型细胞因子、组胺含量升高,空肠和肺组织发生病变,表明重组Ara h 1蛋白可以导致小鼠发生Th2型过敏反应,且有与天然Ara h 1蛋白相似的致敏性。同时RBL细胞模型结果显示重组Ara h 1蛋白还可导致RBL细胞脱颗粒,释放β-己糖苷酶,进一步表明重组Ara h 1蛋白具有致敏性。

花生过敏原Ara h2与Ara h6的生物信息学比较研究

运用生物信息学技术比较Ara h2和Ara h6从一级结构到三级结构的异同．结果发现，Ara h2含有一段独有的序列（60～73），其中包括Ara h2三个主要IgE抗原表位中的两个．以Ara h6为模板进行同源建模获得了Ara h2的立体结构，与Arah6的结构叠加拟合后，该结构多出一段由蛋白环连接的反向平行β-折叠（58～72），其伸展结构同样包含上述两个IgE表位的蛋白序列．探讨从Ara h2和Ara h6的一级结构到三级结构产生免疫学活性差异的原因，为研究花生过敏机制及设计低致敏原疫苗奠定基础．

花生主要过敏原Ara h1的纯化

采用硫酸铵沉淀及凝胶过滤层析方法,纯化花生主要过敏原蛋白Ara h1,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合免疫印迹实验(Western-Blotting)进行鉴定。结果表明:可纯化出纯度90%以上的Ara h1过敏原蛋白。

花生主要过敏原Ara h1单克隆抗体的制备与应用

目的制备与鉴定抗花生主要过敏原Ara h1单克隆抗体,建立双单抗ELISA法,检测食品中花生过敏原。方法以花生主要过敏原Ara h1为抗原免疫Balb/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞NS-1。半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。间接ELISA法和Western blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏源的交叉反应性。建立双单抗夹心ELISA法检测食品中的花生过敏原。结果共获得抗Ara h1细胞株4株,分别命名为2G9、5G4、5B5、2C7,效价均高于1∶106。经抗体亚型鉴定,4株抗体均为Ig G1型。Western blot的结果表明4株抗体均能识别Ara h1,其中2G9与5G4结合能力较强。在特异性检测实验中,2G9和5G4与其他种类过敏原无交叉反应。通过建立双单克隆抗体夹心ELISA法,发现花生Ara h1蛋白的检出低限为:5 ng/ml,标准曲线在~80 ng/ml范围内线性良好。利用此法检测了10种食品,结果显示在5种含有花生成分的食品中均检测到了花生过敏原。结论获得高效价抗体4株,建立了高效、高特异性的食品中花生过敏原的检测方法,为食品中花生过敏原的检测提供了依据。

重组花生过敏原Ara h2的生物合成

为获得重组花生过敏原Ara h2。通过RT-PCR合成cDNA,并以此为模板进行PCR扩增目的基因Ara h2,扩增产物经纯化后克隆至pMD19-TSimple载体中,构建重组质粒pMD19-T-Ara h2。上述重组质粒经酶切纯化后定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-Ara h2,并转化表达宿主菌BL21-codonPlus(DE3)-RIPL中,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明,该表达蛋白大小约为46kD,与理论值相符。通过Glutathione Sepharose 4B凝胶亲和层析方法纯化融合蛋白GST-Ara h2,获得融合蛋白纯度约为90%。Western blotting分析表明,经纯化的融合蛋白能与抗Ara h2兔血清发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的免疫原性。

花生过敏原Ara h 8的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的:克隆花生主要过敏原Ara h 8基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h 8基因;将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序。将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白Ara h 8;Western blot检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明克隆的花生Ara h 8基因片段全长为474 bp,编码157个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blot结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性。结论:成功克隆并表达纯化了花生过敏原Ara h 8,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。

花生过敏原Ara h2.02原核表达方法条件的研究

将重组质粒pET-32a(+)-Arah2.02转化表达宿主菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS—PAGE电泳分析,结果显示表达的蛋白大小约为38kDa。进一步用通用His标签抗体进行Western Blotting检测,结果表明成功克隆表达了花生过敏原Arah2.02。为获得较多的重组蛋白Arah2.02,分别对IPTG浓度、摇床转速、诱导温度和时间等条件进行选择,确定最佳条件为:IPTG浓度0.3mmol/L,摇床转速220r/min,诱导温度37℃,诱导时间2h。

基于焦磷酸测序的花生过敏原基因Ara h6检测技术研究

应用焦磷酸测序技术建立了检测食品中花生过敏原基因Ara h6的快速检测方法,该检测方法对花生过敏原成分具有很好的特异性和重现性,测序结果在GenBank中进行同源性比对分析,表明目标序列能够作为鉴定花生过敏原成分很好的特征序列,为食品中的花生过敏原成分快速检测提供良好的技术支撑,保证了食品进出口和食用安全。

热加工花生的蛋白分离及其过敏原纯化方法研究进展

花生不仅本身是一种营养丰富的食品,而且作为原料或配料广泛应用于食品加工中。然而花生及其制品是FAO/WHO认定的八大类食物过敏原之一,可导致严重的过敏反应,通常伴随终身,甚至危及生命。不同地区的人们食用花生的加工方式不同,其花生过敏的患病率也有所不同,热加工是花生的主要加工方式,因此各类热加工导致的花生致敏性变化成为研究热点。过敏原蛋白的分离作为花生热加工研究中的重要步骤,也变得十分重要。本文主要对常见的3种热加工花生(水煮、油炸和烘烤)中的花生蛋白分离及其过敏原纯化的方法研究进行综述。现有的花生热加工研究中蛋白分离技术主要是通过溶剂浸提;而过敏原纯化技术主要是借助层析法,根据各组分在物理化学性质上的差异进行纯化;此外还可以根据最终研究目的的不同采用其他的辅助方法达到分离纯化效果。通过对现有分离纯化方法进行了解和比较,可为热加工花生过敏原蛋白的分离纯化甚至进一步的分析检测提供理论参考和指导。

设计和鉴定花生主要过敏原Ara h 2低致敏原衍生物

构建序列重新组合的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。将Ara h 2基因进行合理的缺失和重排,并将重排后的基因T-Ara h 2克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;再用IPTG诱导其表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western-blotting和ELISA鉴定该重组蛋白的低致敏原性。测序结果表明重排后的序列成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)上。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western-blotting和ELISA结果均表明:T-Ara h 2与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE显著降低。成功构建了基因重排的Ara h 2表达载体,该重组蛋白具有良好的低致敏原性。

晒干处理对花生过敏原蛋白潜在致敏性的影响

花生是八大食物过敏原之一,花生过敏通常是终身的。晒干是花生加工的重要环节,本研究通过对新鲜花生进行去壳晒干和带壳晒干2种不同的晒干处理,探索不同晒干方式对花生过敏原蛋白潜在致敏性的影响。采用凯氏定氮法、二喹啉甲酸法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定花生及蛋白提取液中的蛋白浓度和过敏原蛋白的组成,用圆二色谱、紫外扫描光谱检测花生蛋白的结构变化,用血清免疫球蛋白E(immunoglobulin E,Ig E)结合能力表征花生蛋白潜在致敏性的变化。结果显示,晒干处理后,花生蛋白与血清Ig E的结合能力显著增强(P<0.05),去壳晒干的花生蛋白质二级结构比带壳晒干的花生更有序,三级结构更加紧凑,带壳晒干的花生蛋白可能因为其结构较为松散,故与Ig E结合能力更强。

超高效液相色谱-电喷雾质谱法检测花生过敏原Ara h 2

目的建立烘培食品中花生过敏原Ara h 2的液相质谱联用定量检测方法。方法选择花生蛋白中的致敏蛋白Ara h 2作为目标蛋白,筛选出该致敏蛋白的特异肽,人工合成特异肽标准品和特异肽内标,从而建立直接检测花生致敏蛋白Ara h 2的准确定量方法。同时还对全国不同地区的20种花生中致敏蛋白Ara h 2的含量进行检测分析,初步统计得出致敏蛋白Ara h 2和花生蛋白的换算系数,并以Ara h 2作为生物标记物检测10种烘培食品中花生蛋白的残留量。结果花生样品中致敏蛋白Ara h 2的定量限为4.45μg/g,回收率在106.0%~107.8%之间。烘培食品中,定量限可达到6.23μg/g,回收率在107.0%~113.2%之间。结论本方法特异性强、灵敏度高、定量准确,具有良好的应用前景。

花生中主要过敏原Ara h1的纯化

为了得到花生中引起过敏反应的主要致敏成分Ara h1,以新鲜花生为材料,通过粉碎、脱脂、硫酸铵分步盐析等方法进行粗提;并用离子交换柱以及凝胶柱等方法来进一步纯化过敏原Ara h1。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析了纯化后的过敏原Ara h1的纯度,并用高效液相色谱法测定其纯度达到90%以上。

花生过敏原Ara h7基因的克隆及序列分析

目的克隆花生Ara h7基因cDNA序列,并对其序列进行分析。方法采用Trizol法,从花生子叶中提取花生RNA,经反转录PCR,克隆花生Ara h7 cDNA序列;采用生物信息学软件对Ara h7序列进行分析,预测蛋白结构及功能。结果 Ara h7 cDNA序列有482 bp,编码160个氨基酸。生物信息学分析结果显示Ara h7蛋白是一种亲水性蛋白,分子量为18.881 kDa,具有9个潜在的磷酸化位点,5个不同的B细胞线性表位。结论本研究成功克隆了Ara h7 cDNA序列,并采用生物信息学软件分析了基因编码的蛋白的特征。

花生过敏原结构及加工研究进展

花生过敏已成为世界各地普遍存在的公众性健康问题,得到广泛关注,对花生过敏原的研究日渐深入。过敏原结构为加工降低其过敏原性提供基础,用各种加工手段降低甚至消除花生过敏原蛋白的致敏性,尤其是Ara h 1、Ara h 2和Ara h 6、Ara h 3/4这些含量高、致敏性强的主要过敏原的致敏性已备受重视。本文主要介绍花生过敏原研究在结构及加工方面的进展,以期为低致敏甚至脱敏花生的生产提供一定的参考,以保证实现丰富食物过敏患者食品选择的同时,有效降低食品安全风险。

花生致敏蛋白Ara h2提取纯化及免疫分析

对花生致敏蛋白Ara h2的提取纯化方法进行探究以及对纯化后的花生致敏蛋白Ara h2的免疫特性进行鉴定,以建立得率较高、操作简单的蛋白纯化方法。