花生主要过敏原Ara h1单克隆抗体的制备与应用

目的制备与鉴定抗花生主要过敏原Ara h1单克隆抗体,建立双单抗ELISA法,检测食品中花生过敏原。方法以花生主要过敏原Ara h1为抗原免疫Balb/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞NS-1。半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。间接ELISA法和Western blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏源的交叉反应性。建立双单抗夹心ELISA法检测食品中的花生过敏原。结果共获得抗Ara h1细胞株4株,分别命名为2G9、5G4、5B5、2C7,效价均高于1∶106。经抗体亚型鉴定,4株抗体均为Ig G1型。Western blot的结果表明4株抗体均能识别Ara h1,其中2G9与5G4结合能力较强。在特异性检测实验中,2G9和5G4与其他种类过敏原无交叉反应。通过建立双单克隆抗体夹心ELISA法,发现花生Ara h1蛋白的检出低限为:5 ng/ml,标准曲线在~80 ng/ml范围内线性良好。利用此法检测了10种食品,结果显示在5种含有花生成分的食品中均检测到了花生过敏原。结论获得高效价抗体4株,建立了高效、高特异性的食品中花生过敏原的检测方法,为食品中花生过敏原的检测提供了依据。

重组花生过敏原Ara h2的生物合成

为获得重组花生过敏原Ara h2。通过RT-PCR合成cDNA,并以此为模板进行PCR扩增目的基因Ara h2,扩增产物经纯化后克隆至pMD19-TSimple载体中,构建重组质粒pMD19-T-Ara h2。上述重组质粒经酶切纯化后定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-Ara h2,并转化表达宿主菌BL21-codonPlus(DE3)-RIPL中,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明,该表达蛋白大小约为46kD,与理论值相符。通过Glutathione Sepharose 4B凝胶亲和层析方法纯化融合蛋白GST-Ara h2,获得融合蛋白纯度约为90%。Western blotting分析表明,经纯化的融合蛋白能与抗Ara h2兔血清发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的免疫原性。

高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的宏观形态

采用图像处理技术对高山被孢霉(Mortierella alpina)发酵过程中的不同形态进行分析,并对其产花生四烯酸(ARA)能力进行了比较。研究发现:复合N源中蛋白胨与酵母粉比例是影响高山被孢霉宏观形态的重要因素,球形形态生长的菌体中ARA产量较分散,菌丝体中ARA产量高;在球形形态中,空心球的菌体生物量低,ARA比例低,蓬松球可以兼顾菌体高生物量、高油脂比例及高ARA比例。产ARA能力由生物量、油脂比例及油脂中ARA比例共同决定。结果表明:直径大约4 mm、成核区域面积大约为43.6%、紧密度为71.36的蓬松球形态,是高山被孢霉一种相对较佳的发酵形态,其菌体产ARA能力分别是空心球和分散丝状菌体产ARA能力的2.01和2.70倍。

ARA微胶囊粉末稳定性及不良气味物质研究

本文运用60℃加速方法研究了经过微胶囊化处理的ARA粉剂的稳定性问题,并利用顶空气相色谱-质谱法对ARA粉剂中的不良气味物质进行分析,确认出24种组分。用峰面积归一化法测定,其质量分数占总挥发性组分峰面积的97.56%。主要成分为:己醛(70.21%)、戊醇(8.06%)、1-辛烯-3-醇(5.23%)、2-戊基-呋喃(3.71%)、2-辛烯醛(2.39%)、2-庚烯醛(2.18%)、2-庚酮(1.59%)和正庚醛(1.00%)。根据气味分析确认己醛为不良气味特征物质,开发了一种简单、便捷的检测己醛含量的顶空-气相色谱法。该方法通过检测ARA微胶囊粉末的己醛含量来评判产品是否变质,是一种较好的评价ARA微胶囊粉末稳定性的检测方法。

多聚赖氨酸预处理花生DNA疫苗对花生蛋白诱导变态反应的作用

目的探讨经多聚赖氨酸预处理的花生DNA疫苗对花生蛋白诱导变态反应的预防作用。方法以编码花生蛋白Arah2的质粒DNA(pArah2)、经多聚赖氨酸(PLL)预处理的质粒DNA(PLL-pArah2)、磷酸盐缓冲液(PBS)和PLL对照皮内注射免疫Balb/c小鼠,1次/周,连续3周,再经腹腔注射纯化的Arah2蛋白免疫小鼠。在不同时间点收集各组小鼠血清,用酶联免疫吸附法检测血清中Arah2特异性IgG1、IgG2a抗体以及血清总IgE抗体水平,分析DNA疫苗免疫对蛋白诱导小鼠变态反应的影响。结果 pArah2及PLL-pArah2质粒DNA免疫后,小鼠血清Arah2特异性IgG1和IgG2a升高,但血清总IgE抗体未见升高。Arah2蛋白免疫后,不同处理组血清总IgE、Arah2特异性IgG1和IgG2a抗体水平均升高,但pArah2组血清总IgE和Arah2特异性IgG1抗体水平明显低于PBS对照;PLL-pArah2组血清总IgE和Arah2特异性IgG1、IgG2a抗体水平不仅明显低于PBS和PLL对照,且明显低于单纯pAra h2组。结论经多聚赖氨酸预处理的Arah2 DNA免疫能够更好地抑制之后蛋白免疫产生的变态反应应答,为DNA疫苗治疗过敏性疾病提供了新的思路。

大气压化学电离源-质谱法分析花生四烯酸油脂成分

采用大气压化学电离源-质谱法（APCI-MS）对花生四烯酸（ARA）油脂成分进行定性分析。结果表明：在APCI正离子模式,高压放电针电流8μA,样品锥孔电压5 V,离子源温度130℃,APCI加热器温度500℃,脱溶剂气流量300 L/h,锥孔气流量100 L/h,质量扫描范围（m/z）100~1 000的质谱条件下,分析得出ARA油脂中含有167种甘油酯,其中有10种甘油一酯、55种甘油二酯及102种甘油三酯。此方法简单、快捷,不仅适用于油脂中的饱和脂肪酸甘油酯的定性分析,还可以用于不饱和脂肪酸甘油酯的定性分析。

花生过敏原蛋白Ara h2的分离纯化研究

食物过敏是食品安全领域内比较突出的问题,花生因其高致敏性被列为八大致敏原之首。在花生致敏原中,Ara h2是主要致敏原。以Ara h2为研究对象,通过对花生脱脂,设置不同浸提液、pH、料液比、浸提时间的蛋白质浸提条件,透析分离纯化目标蛋白质,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对优化结果进行鉴定,正交试验确定最佳浸提工艺。结果表明:最佳浸提工艺参数为浸提时间90min、浸提pH值7.4、浸提料液比1∶8、浸提液Tris-HCl缓冲液。在此优化条件下目标蛋白质含量可达1.58mg·mL^(-1),浸提率可达47.8%。

缺刻缘绿藻的光合膜脂与中性脂及其脂肪酸组成在氮饥饿/氮恢复培养过程中的变化

对缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)进行氮饥饿(4 d)/氮恢复(4 d和8 d)培养,研究其细胞中三酰甘油(TAG)和光合膜脂,主要是单半乳糖二酰甘油(MGDG)和二半乳糖二酰甘油(DGDG)的含量和脂肪酸组成的变化。结果表明TAG含量在氮饥饿胁迫下显著上升,而在氮恢复培养下逐渐下降;DGDG含量的变化趋势与TAG相反;MGDG的含量则始终呈现上升趋势。对脂肪酸组成进行分析发现花生四烯酸(ArA)主要存在于TAG中,且TAG中ArA的含量在氮饥饿胁迫下显著上升,并在氮恢复培养下逐渐下降。DGDG中ArA含量在氮饥饿/氮恢复过程中的变化与TAG中的相反;MGDG中ArA的含量在不同培养条件下始终增加。该结果表明在氮饥饿胁迫下DGDG可能向TAG合成提供ArA,而TAG在氮恢复后可向光合膜脂提供脂肪酸以供其合成。

ARA及DHA粉剂稳定性检测方法研究

分别采用食品氧化性测定仪(OXI)检测方法与传统的恒温箱(60℃)加速稳定性方法研究了花生四烯酸(ARA)及二十二碳六烯酸(DHA)微胶囊粉末产品的稳定性,结果显示:这2种方法均能较好检测出ARA和DHA粉剂的稳定性。而OXI检测方法较传统方法具有连续性好,实验用时短,样品用量少等优点。但是OXI不能反映微胶囊粉末样品的溶解情况,因此在进行OXI实验的同时在60℃条件下观察样品的颜色变化并定期进行样品溶解是一个较好的评价ARA和DHA粉剂稳定性的实验方法。

不同添加量ARA及DHA在婴幼儿乳粉中的稳定性研究

采用55℃加速方法对不同添加量的ARA和DHA婴儿配方乳粉进行了稳定性实验,研究了不同添加量的ARA和DHA婴儿配方乳粉的过氧化值、ARA及DHA含量、色泽及气滋味的变化情况。研究结果显示,不同添加量的ARA和DHA婴儿配方乳粉的这些检测指标在加速实验中没有明显差异,为在婴儿配方乳粉中提高ARA和DHA添加量的可行性提供了一定的理论支持。而且该方法较传统的常温货架期实验能更快速地评估乳粉的稳定性。