花粉介导法获得油菜转基因植株研究

以甘蓝型冬油菜品种晋油7号为受体,载有GUS基因的质粒pBI121为供体,在7.5%的蔗糖等渗溶液中,通过花粉介导转化方法将GUS基因导入油菜花粉,随着花粉管的萌发进入胚囊,参与有丝分裂,将外源质粒转入受体材料。经田间植株性状比较、GUS组织化学定位检测、PCR扩增检测及PCR-Southern杂交检测,证明外源GUS基因已整合到油菜基因组中。

谷子花粉介导法转几丁质酶基因的研究

以晋谷 2 1号A不育系材料为受体 ,以质粒pGLⅡ -RC - 1为供体 ,在 10 %浓度的蔗糖溶液中 ,加入花粉与含有质粒DNA ,应用YKH -I型液体快速混合器进行震荡处理得到花粉处理液 ,然后辅以人工授粉的方法将花粉处理液滴注晋谷 2 1号不育系的柱头上获得种子 ,将F1的种子经除草剂筛选和PCR检测 ,有目的基因特异带出现。实践证明 :利用花粉介导法进行谷子几丁质酶基因转移方法可行 ,为谷子转基因提供了一个新方法。

花粉介导法将TaPHR1∷GFP融合蛋白基因导入玉米

利用超声波辅助花粉介导基因转化法,将小麦耐低磷调控基因TaPHR1和GFP构建成的融合蛋白基因(TaPHR1∷GFP)导入3个玉米自交系郑58、昌7-2和PH6WC中.结果表明:3个自交系的转化效果存在基因型差异,郑58是很好的转化受体材料,平均结籽穗率、每穗平均结籽数、BASTA除草剂抗性和转基因植株PCR阳性率均优于昌7-2和PH6W;对T1代植株进行Southern杂交表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因已整合到玉米基因组中;RT-PCR结果显示,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到有效转录;通过对发芽籽粒进行GFP荧光观察表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到了表达.

葡萄花粉介导转基因超声波处理参数的选择

利用花粉介导附加超声波对葡萄花粉进行处理，结果表明，超声波处理各参数对葡萄花粉有极显著影响，而且参数间存在交互作用。因此，用超声波处理花粉选择处理参数时，应考虑其交互作用。考察显著性检验结果，在试验花粉破碎率和萌发率的稳定性和不破坏DNA的基础上，超声波处理参数以功率100～120W，处理时间4～5s，间隙时间2～68，处理次数6为最佳组合选择范围。GUS活性检测结果，花粉有4‰的转化率。

风、蜜蜂因素对转Cry1Ac基因棉花花粉介导的基因漂移的影响

在温室内人工创造风力和释放传粉昆虫蜜蜂的条件下,应用PCR和蛋白试纸条结合的方法检测外源Cry1Ac基因通过花粉漂移至非转基因棉的频率和距离。结果表明:风力处理和蜜蜂处理的基因漂移频率均显著高于空白对照。漂移至非转基因亲本棉石远321的频率显著高于陆地棉中棉所35和海岛棉吉扎1号。漂移至石远321的频率随距离远近差异显著,而漂移至中棉所35和吉扎1号的频率在不同距离上差异不显著。风力处理共检测到阳性样本72个,在检测范围内,漂移至石远321的最远距离为25.6 m,漂移至中棉所35和吉扎1号的最远距离均为19.2 m。蜜蜂处理中共检测到阳性样本75个,在检测范围内,漂移到常规棉的最远漂移距离均达到设置最远处36 m,并在此处达到峰值。本研究可为转基因棉花基因漂移生态风险性评估提供参考。

花生CpTI基因转化—花粉介导法

利用花粉作为外源基因的载体将抗虫基因(CpTI基因)转入花生中。以花生仲恺01号为受体,以PCB302-3质粒外源基因为供体。在花生开花期,收集花粉与质粒DNA混合并附加超声波处理,然后以人工授粉的方法将外源基因导入受体中。利用花粉作为载体介导外源基因转化,避免了传统的基因枪法和农杆菌转化所要求的组织培养技术,转化方法简单、易操作,具有很强的实用性。

花粉介导法将萝卜抗菌肽基因导入野罂粟的影响因素研究

以野罂粟开放花蕾为受体,载有萝卜抗菌肽AFP(antifungal protein)基因的质粒pBIAFP为供体,在不同浓度的蔗糖溶液中,加入新鲜花粉与含有目的基因的质粒DNA,应用SKH250LH型超声波震荡器进行震荡处理得到花粉处理液,在不同的时间用带有Coolsnap的OLYPUS光学显微镜下观察野罂粟花粉萌发情况;在不同授粉时间后,辅以人工授粉的方法将花粉处理液滴注野罂粟柱头上,套袋后获得种子,测定其结实率。实验证明:利用花粉介导法进行萝卜抗菌肽基因转化,以蔗糖浓度11%,处理后10-15h后的野罂粟花粉萌发最好;在蔗糖浓度8%的溶液中,以5h的结籽量较好。后代经卡那霉素筛选和PCR检测,初步证明外源AFP基因整合到野罂粟基因组中,并获得转基因T1代。为特殊中药材育种提供一个新方法。

花粉介导法将水稻OsSIK1基因导入玉米自交系的研究

采用超声波辅助的花粉介导法,将含有OsSIK1基因的植物表达载体导入3个玉米自交系中,在当代直接得到了T0转化处理种子。卡那霉素筛选和PCR检测表明,外源基因已整合到玉米基因组中。通过对这3个自交系的转化处理结实率、转化率和导入基因遗传率的比较分析,证明花粉介导法对不同自交系品种的转化率之间存在差异,从而得出自交系品种郑58和昌7-2更适合采用花粉介导法进行遗传转化。

超声波辅助花粉介导转基因方法的研究进展

超声波辅助花粉介导植物转基因方法是拥有国内自主知识产权的植物转化手段,该方法在玉米、油菜、花生等作物上的转化研究均取得积极进展。为较详尽了解国内外应用该方法进行植物转化研究的现状,针对该方法与其他植物转化方法比较所体现出的优势以及存在的问题进行了总结,以期为相关研究者提供一些参考资料,并为该方法的进一步改进完善提供依据。

棉花花粉介导基因转化的初步研究(简报)

棉花是干柱头花，花粉粒对低渗透压的溶液非常敏感，极易破裂。１９９７年我们对海南和南疆以及北疆都进行了不同花粉萌发培养基和渗透压的调节的研究工作，设计了不同品种、不同渗透压、不同糖类、不同离子浓度、不同激素组合、不同温度等多因子不同水平的试验，结果表明...

花粉介导法获得耐草甘膦玉米植株及其耐性研究

为获得耐草甘膦转基因玉米植株,进而研究其除草剂耐性及外源基因的遗传特性,以质粒p BI101-aroA-M12为外源基因供体,以玉米自交系昌‘7-2’为受体,采用花粉介导法将外源基因导入玉米自交系中。PCR扩增、Southern杂交分析的结果证明获得了54个转基因植株;对其后代株系的分子检测及田间生物学鉴定,结果证明目的基因可以稳定遗传给后代植株,且赋予和提高了转基因植株的除草剂耐性。目的基因在转化体中的遗传规律研究,结果显示导入的目的基因在F2受体植株中以3∶1的比例发生遗传分离,符合孟德尔单因子显性遗传分离规律。ELISA分析和蛋白质浓度测定的结果证实目的基因在转化植株中得到表达,表达量介于40.5-112.6 ng/g叶片鲜重之间,目的基因表达量与该植株的除草剂耐性性状间呈极显著相关,r=0.942 3(P<0.01)。最终研究获得了4个高草甘膦耐性的转基因纯合株系。

超声波辅助花粉介导法获得转BtCry1Ac基因玉米的研究

为了进一步分析玉米基因功能及基因转化,并为玉米抗虫提供种质资源,利用超声波辅助花粉介导法,将抗虫基因Cry1Ac导入玉米优良自交系昌7-2中,获得大量的转基因植株。结果表明:转基因植株经过草铵膦抗性筛选、PCR检测、BT蛋白试纸条检测和室内抗虫性鉴定等分析,最后获得高抗玉米螟的转BtCry1Ac基因株系9个。培育出了高抗玉米螟的种质资源材料,同时也建立了超声波辅助花粉介导转化玉米的高效转化体系,该方法是简捷、快速有效、无基因型限制的植物转化方法。

野罂粟花粉介导法转萝卜抗菌肽基因方法研究

以野罂粟开放花蕾为受体,以载有萝卜抗菌肽AFP(antifungal protein)基因的质粒pBIAFP为供体,在不同浓度的蔗糖溶液中,加入新鲜花粉与含有目的基因质粒DNA,进行了野罂粟基因转化试验,结果表明,蔗糖浓度110 g/L是花粉介导法进行野罂粟基因转化的理想介质,不会对花粉萌发能力造成大的影响,花粉粒破损率比较小。

花粉介导的遗传化研究进展

植物遗传转化技术是植物科学基础理论与应用研究的有力武器，已成为植物遗传改良的重要途径之一。但是、目前遗传转化采用的受体系统，大都需要体外培养和植株再生过程，才能获得转基因植株。其中、基因型限制和遗传变异是该技术不可逾越的两大障碍。花粉管通道法可省去转化体的本培养，不过、多数植物受花器结构的限制而难以经花柱注射DNA，只能向子房注射，并不是真正的“花粉管通道”。又由于此法外源基因的导入发生在授粉之后，因此该方法亦不属于花粉遗传转化。利用小孢子胚胎发生体系进行遗传转化与利用花粉作为外源DNA的媒介。继而、通过授粉受精获得转基因种子，是目前花粉遗传转化的两个重要方面和活跃的研究方向。前者仍需要离体再生系统，后者则可以利用植物自身的再生机制，本文称之为花粉介导法（pollen-mediated transformation)。该方法通过自然的胚胎发育过程获得转基因子代，避免了组织培养过程中的遗传变异和转基因植株的嵌合现象，可望成为简便快速的植物遗传转化体系。目前对花粉介导的遗传转化进行专门评述的文献较少，本文对该领域的研究分三个层次进行了综述。一、外源基因转化方法，小孢子或由小孢子形成的胚状体是很有潜力的遗传转化受体，采用显微注射、电激法、农杆菌共培养和基因枪法进行转化均有成功报导。向萌发或未萌发的成熟花粉中导入外源基因，已尝试多种方法。早期转化方法是将花粉与外源DNA混合培养，一些研究者观察到子代植株的表型变化，但缺乏分子证据。利用特殊食品转化花粉的研究较多。,由于生殖细胞太小，显微注射较为困难，尤其是三核花粉，同时向两个精子注入DNA更为困难。然而、通过玉米萌发孔注射DNA获得成功。电激转化法多以萌发花粉为受体。早在1987年Mishra等证实了该方法的可行性。电激转化Nicotiana gossei花粉，约有90％可育。利用基因枪已将外源基因导入烟草、Nicotiana gossei、Nicotiana glutinosa、黄花烟草、紫露草、玉米、番茄、百合、牡丹以及针叶树种的花粉粒。对包裹外源基因的金属粒子在受击花粉中的分布亦进行了观察。Sanford(1983)最早讨论了利用激光束对花粉粒击孔的可行性，但至今未见利用该方法获得转化的证据。脱外壁花粉以及花粉原生质体利于电激法转化。电激紫菜苔花粉原生质体的转化效果是电激花粉粒的100倍。二、受体细胞，花粉成熟过程中要经过两次有丝分裂，在有丝分裂期间导入外源基因有利于整合。但花粉萌发过程中，药粉和柱头释放的核酸酶均降解外源DNA，可能是导致转化失败的重要原因之一。温度、PH值和一些化学试剂能影响花粉中核酸酶活性。如：提高培养基中EDTA或MgSO4浓度等；KNO3或PEG可抑制DNA酶活性而不影响转化后花粉的萌发。用^32P同位素示踪法观察了烟草自交不亲和系S－核酸酶的作用。有关外源基因转化后的显微观察和追踪研究则末见报导。用花粉为受体进行转化的启动子中，除CaMV35S外，还有LAT52、LAT56、ChiPA2、Ubiq1-I1、TR2、PSI、Zm13、Actl等。比较这些启动子作用的论文较多，但对某一启动子、如何提高其强度的论文较为少见。个别研究已开始涉及具有应用目的的基因。你数研究者采用Gus等报告基因进行转化实验。Gus检测时，假阳怀和背景活性常常影响检测效果和研究结果的可靠性。二细胞型花粉的内源核酸酶活性受PH值影响，中性（PH7．0）或偏碱性时可排除这种影响。三、转化后代的获得，以不同发育阶段和状态的雄配子体为受体进行转化，获得转化后代的难易程度不同。利用转化或未转化的小孢子授粉结实，目前仍有一定局限性。值得提出的是，在烟草、玉米等许多植物中建立了小孢子体外成熟的实验体系，不足的是这一体系尚未实用化。研究表明，用转化的成熟花粉授粉于原品种柱头可正常结实。电激转化的萌发花粉或专座经未萌发的成熟花粉对花粉生活力的影响较小，但有关其定量报道较为少见。利用脱外壁花粉及花粉原生质体进行授粉，目前仍处于探索阶段。在受精过程中，可能存在转化与未转化花粉的竞争。为缓解竞争压力，确保获得高频率的转化后代，有必要探讨高效的微量活体授粉技术；有必要采取促进花粉萌发和防止果实（或种子）脱落和败育的措施；有必要提早筛选转化本。甚至筛选出转化的花粉去授粉。然而这方面的报导较为少见。应用花要提早筛选转化体，甚至筛选出转化的花粉去授粉。然而这方面的报导较为少见。应用花粉介导法获得稳定转化的成功,目前仅有一例。Leede-plegt等通过花粉介导法获得了转基因（NPTⅡ和GUS）Nicotiana glutinosa,花粉的瞬时表达率为3％，收获种子中稳定转化的比率为2×10^－6。花粉介导法的转化成功，无疑为离体再生系统不完善甚至有缺限植物的转化带来了希望，向人们展示了基因工程和常规育种的有机结合模式。降低花粉萌发过程中核酸酶活性、选择利于外源基因进入生殖细胞的花粉细胞状态、建立高效的微量授粉技术、提前筛选转化体是获得高频率稳定转化的研究方向。

超声波处理对苹果花粉介导转基因的影响

为了探讨花粉介导转基因过程中附加超声波处理对苹果品种丹霞和嘎拉花粉的影响,对苹果花粉处理的缓冲液和超声波的各参数进行了选择,设置了不同的缓冲液pH值、蔗糖浓度;超声波处理功率、时间、次数等.结果表明:适合苹果花粉处理的缓冲液蔗糖浓度为10%,pH值为5.4;超声波处理功率、时间、次数等各参数对苹果花粉的萌发率和破碎率有显著影响.

超声波处理花粉介导‘黄花’梨遗传转化体系的建立

【目的】建立超声波处理‘黄花’梨花粉介导插入外源基因的技术体系。【方法】以‘黄花’梨花粉为试材,检测不同蔗糖溶液中梨花粉破损率;通过中心组合设计方法,对超声波处理功率、处理时间、间隙时间、处理次数4个因子进行优化;利用含荧光蛋白基因的表达载体pCAMBIA 1304检测转化效率。【结果】梨花粉的适宜等渗溶液为15g.L-1蔗糖溶液。超声波处理的梨花粉受体最佳参数为：超声波处理功率160~170 W,处理时间6~7 s,间隙时间7 s,处理次数7次。采用加入含GFP（green fluorescent protein）基因的pCAMBIA 1304表达载体质粒检测优化的超声波处理组合,梨花粉外源基因的插入效率为3%。【结论】研究确定了超声波处理‘黄花’梨花粉遗传转化体系。

花粉介导的花青素调节基因NtAn2转化玉米研究

利用超声波辅助花粉介导法将花青素基因Nt An2导入玉米自交系郑58,并优化超声波辅助花粉介导基因转化方法的遗传转化体系。以新鲜的郑58玉米花粉为试验材料,检测其在不同浓度的蔗糖溶液中的体外萌发率;通过正交试验设计,对超声波处理功率、处理时间、处理次数3个因素进行优化,以确定最优转化组合;对收获的籽粒进行PCR检测。结果表明,玉米自交系郑58的花粉最适宜的蔗糖溶液浓度为20%;超声波处理最佳参数为:处理功率150 W,处理时间5 s/次,处理次数6次;PCR分子检测表明,其中有3粒含有阳性条带,且这3粒中有2粒呈紫色,初步证实,Nt An2已被整合到玉米基因组中,并且可以被用于对转化子的直观筛选。研究确立了超声波辅助花粉介导法遗传转化的最佳体系,为提高该植物基因转化方法的效率奠定了基础。

基于花粉介导法转化的玉米自交系抗病植株的获得

【研究目的】将几丁质酶基因导入玉米自交系,获得抗玉米丝黑穗病的转基因植株。【方法】采用花粉介导法进行转化,获得的种子及后代植株检测方法包括:潮霉素抗性筛选、PCR扩增、Southern blot杂交分析以及田间抗病鉴定。【结果】通过转化获得种子43粒,对种子进行潮霉素抗性筛选得到9株抗潮霉素植株;经PCR检测,Southern blot杂交分析得到5株转基因植株。田间抗病鉴定结果显示,转基因植株或株系的丝黑穗病抗性提高1～2级。【结论】花粉介导法转化玉米自交系是获得抗病育种材料的一条快捷、有效的途径。

利用花粉介导法获得油菜RNAi转基因植株

以甘蓝型油菜7B为试验材料,利用花粉介导法将携带RNA干扰的HKL1基因的pCaMHKL1-RNAi质粒转入7B中,获得转基因油菜植株,通过PCR分别对T_1,T_2植株进行了转基因鉴定,并对转基因植株后代的生长发育进行研究。结果表明,T_2的RNAi植株与野生型植株相比,出真叶时间较晚,株型较矮小;qRT-PCR结果表明,RNAi植株中HKL1基因的相对表达量为野生型植株的24.6%~67.9%;不同的RNAi植株中HKL1基因的表达量各不相同;利用花粉介导法在甘蓝型油菜中进行RNAi质粒转化,外源基因可以在后代植株中稳定遗传。花粉介导法较之农杆菌侵染、基因枪法等基因转化方法操作更加简单、适用性更强。

花粉介导法获得玉米转基因植株(英文)

利用花粉作为外源基因的载体进行遗传转化在玉米 (ZeamaysL .)上获得了成功。以玉米自交系太 910 1、综 31等为受体 ,以pGLⅡ_RC_1质粒为供体 ,在玉米开花期 ,用花粉与质粒DNA混合并附加超声波处理 ,然后辅以人工授粉的方法将外源基因导入到受体中。DNA斑点杂交和PCR扩增以及PCR_Southernblot杂交检测结果证明 ,几丁质酶基因确已导入玉米自交系中。所得结果表明 :玉米花粉可以介导外源基因的转化。利用花粉作为载体介导外源基因转化 ,避免了传统的基因枪法和土壤杆菌法转化所要求的组织培养技术 ,转化方法简单 ,易操作 。