油菜原花色素合成途径基因的克隆及进展

原花色素是类黄酮生物合成途径的终端产物,其基因调控网络在拟南芥、葡萄等基因组已经测序的植物中得到充分阐释。种皮中原花色素的积累与种子颜色、种子休眠和寿命有关。油菜种皮中原花色素的积累决定种皮颜色,同时影响种子的油分含量。本文综述了通过图位克隆、同源克隆和电子克隆等途径克隆油菜原花色素合成途径基因的进展,分析了在油菜中已经克隆的部分原花色素合成途径基因与种皮颜色的关系,提出了如何利用已经公开的油菜、白菜基因组序列通过筛选BAC文库得到基因不同拷贝的全长序列的综合路径,列举了笔者运用该方法已经克隆的部分原花色素合成途径基因拷贝数,以期揭示油菜原花色素形成积累的基因调控网络。

苹果梨果皮花色素苷合成相关基因PyANS的克隆与表达分析

以延边地区苹果梨为试材,采用同源克隆及实时荧光定量PCR的试验方法,研究PyANS基因在苹果梨解袋前后果实着色过程中的表达特性及与花青苷积累的关系。结果表明:PyANS的全长cDNA为1 075bp,其开放阅读框(ORF)编码358个氨基酸,分子量约为40kDa,理论等电点pI为5.38。同源性分析表明与同属的砂梨相似性高达99%,实时荧光定量PCR分析表明PyANS基因受到光诱导表达量迅速上升,去袋1d后表达量迅速增加,第10天时达到最大值,随后迅速下降,最终稳定在同一表达水平,与果实着色和花色苷含量测定的结果相对应,表明PyANS基因对果实花色素苷积累有一定的促进作用。

矮牵牛花色素苷合成途径中的关键酶及其转录调控

类黄酮化合物的生物合成途径是目前研究的最清楚的植物次生代谢途径之一,花色素苷的生物合成属于类黄酮化合物的分支途径,在一些模式植物上已经被清楚地阐明。本文综述了近年来对模式植物矮牵牛(Petunia hybrida)花色素苷合成途径的研究结果,重点阐述对矮牵牛中花色素苷生物合成途径、合成途径中的关键酶以及这些酶转录调控的研究进展,这些将有益于人们进一步利用基因工程的手段进行花卉的分子育种。

马铃薯PAL基因家族的全基因组鉴定及其在非生物胁迫下和块茎花色素苷合成中的表达分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase,PAL)是苯丙烷代谢途径的限速酶和关键酶,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。本研究在马铃薯(Solanum tuberosum L.)全基因组水平下,利用BlastP和HMM 3.1鉴定到8个PAL基因家族成员,利用ExPASy、CELLO、PlantCARE等在线工具,对PAL基因家族成员的进行生物信息学分析。利用PGSC数据库下载的RNA-seq数据,分析了StPALs在双单倍体(DM)马铃薯不同组织部位和非生物胁迫下的表达模式。对3个不同颜色马铃薯块茎组织(皮和肉)进行RNA-seq,以及利用3个不同颜色块茎杂交子代的薯肉进行qPCR分析。结果表明,8个StPALs分布在3、5、9和10号染色体上,它们与烟草(Nicotiana tabacum)PAL的亲缘关系较近。StPAL基因成员的启动子区域内含有多个顺式元件,包括光响应、逆境胁迫响应、激素响应、生长发育相关和转录因子调控的多种顺式元件。StPAL2在匍匐茎中特异表达,StPAL3/5/8在块茎和匍匐茎中特异表达,StPAL3在甘露醇处理下下调表达,StPAL3和StPAL8在热胁迫中上调表达。它们可能参与了马铃薯块茎的发育和非生物胁迫响应。5个StPALs(StPAL3/4/5/6/8)基因在彩色薯肉中均上调表达,可能参与马铃薯薯肉中花色素苷的生物合成。这些结果为进一步了解StPAL基因家族特征,深入分析StPALs基因在马铃薯中的功能提供了理论依据。

光照对紫叶稠李花色素苷合成调控通路的影响

为探究光照强度对紫叶稠李花色素苷合成途径上关键基因及转录因子的影响,对紫叶稠李进行80%遮光处理,通过无参转录组测序,分析差异基因表达量、功能及富集通路情况。结果表明:差异基因主要富集在类黄酮生物合成途径。对花色素苷合成途径相关的差异基因进行荧光定量PCR验证,结果显示,相对全光照条件下,遮光处理下PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT基因表达量下调,MYB6、MYB10转录因子表达量相对上调。

红肉桃两类花色素苷积累模式与相关基因表达差异

【目的】分析中国主要红肉桃种质呈色类型及分子机理,为红肉桃种质优异基因发掘和分子标记辅助选择育种奠定理论基础。【方法】选择8份红肉桃种质和1份白肉桃种质为试材,分别在花后一个月开始采集样品,以后每隔10 d左右采集一次,至果实成熟期为止;用2%甲酸甲醇提取不同种质果肉的花色素苷,分别测定其在510 nm和700 nm的吸光值;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,测定与花色素苷合成相关的13个关键结构基因和调节基因的表达水平。【结果】根据果实发育中后期花色素苷含量的变化趋势可将8份红肉桃种质分为2类,一类种质的花色素苷合成高峰出现在果实成熟期(成熟期积累型),如‘郑引82-9’‘大红袍’‘黑布袋’‘红桃’和‘天津水蜜’;另一类种质的花色素苷合成高峰出现在果实发育中期,在成熟期花色素苷含量有所下降(发育中期积累型),如‘哈露红’‘大果黑桃’和‘乌黑鸡肉桃’。在与花色素苷合成相关的结构基因中,Pp CHS和Pp UFGT的表达量与成熟期积累型种质的花色素苷含量的变化趋势一致;而发育中期积累型种质,果肉中花色素苷的大量积累与所有结构基因的表达趋势一致。在4个调控基因中,只有Pp MYB10.1的表达水平较高,且表达模式同红肉桃种质两类花色素苷积累模式相似。【结论】根据桃果肉着色规律和花色素苷积累模式,8份红肉桃可以分为成熟期积累型和发育中期积累型种质。Pp CHS和Pp UFGT是成熟期积累型种质的关键结构基因,而Pp MYB10.1在供试的所有红肉桃种质花色素苷合成中起关键作用。

马铃薯ARM基因家族的全基因组鉴定及表达分析

ARM蛋白重复序列(Armadillo repeats)广泛存在于高等植物中,它们参与多种细胞过程,如信号转导、核转运以及对多种生物/非生物胁迫的响应。本研究在马铃薯(Solanum tuberosum L.)全基因组水平下鉴定出了54个马铃薯ARM基因家族成员(StARMs),它们不均匀的分布在12条染色体上。根据其蛋白结构和系统发育特征,将54个StARMs分为3个亚家族。片段重复事件在马铃薯ARM基因家族的扩展中起主要作用。共线性分析发现,StARMs与番茄(Solanum lycopersicum)、拟南芥(Arabidopsis)、甘蓝(Brassica oleracea)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)分别有51对、17对、25对、6对和10对直系同源基因,这些基因均在纯化选择下进化。RNA-seq数据分析发现,4个StARM基因在匍匐茎中特异表达,2个StARM基因在根和心皮中特异表达,1个StARM基因在块茎中特异表,还有一些StARM基因参与了马铃薯对生物/非生物胁迫的响应。此外,本研究对3个不同颜色马铃薯块茎组织(薯皮和薯肉)进行了RNA-seq测序,分析了54个StARMs在不同颜色马铃薯块茎组织中的表达模式,并利用qPCR分析了StARMs在3个不同颜色块茎杂交子代薯肉中的相对表达量,筛选出了4个可能参与马铃薯块茎花色素苷生物合成的候选基因。本研究为进一步了解StARM基因家族的特征,深入分析StARM基因在马铃薯抵御生物/非生物胁迫和调控块茎花色素苷生物合成中的功能提供了理论依据。

越橘VcANS基因的克隆及表达分析

【目的】从越橘果实中克隆花色素合成酶(ANS)基因cDNA,为研究越橘花色素苷合成的分子机制奠定基础。【方法】以越橘(Vacciniumspp.)品种"北陆"(V.corymbosum L.)为试材,并以Illumina测序文库(NCBI登录号:SRA046311)中差异表达的Unigene 38125片段为基础,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得花色素合成酶基因全长cDNA,利用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和系统进化分析,探讨ANS基因在不同组织和器官中的相对表达量及其与对应花色素苷含量的关系。【结果】成功克隆了越橘花色素合成酶基因序列,命名为VcANS,GenBank登录号为JN654701。序列分析结果表明,VcANS全长1 424bp,包含93bp的5′非编码区、248bp的3′非编码区和1个长度为1 083bp编码360个氨基酸的开放阅读框,该基因编码的蛋白具有ANS家族普遍存在的2-酮戊二酸和Fe2+-依赖的氧化酶超家族的保守结构域。序列比对和系统进化分析表明,VcANS与杜鹃花科植物亲缘关系最近。在越橘果实发育的不同阶段,VcANS相对表达量的变化与花色素苷含量的变化趋势具有一致性。【结论】获得了越橘花色素合成酶基因全长,推测其对越橘花色素苷的形成起调控作用。

云南野生黄牡丹PlbHLH3转录因子基因的克隆与表达

以云南野生黄牡丹为试材，基于已构建的花瓣转录组数据库，筛选到了24个与花色素苷合成相关的bHLH转录因子蛋白同源性高的Unigene序列，命名为HbHLH1～24。通过开放阅读框（ORF）的氨基酸序列比较和系统进化树分析，发现plbHLH3可能参与调控花色素苷合成，其ORF包含一个2040bp的开放阅读框，编码一个679个氨基酸的蛋白；其氨基酸序列与葡萄VvMYCl和苹果MdbHLH3的亲缘关系最近，相似性达60％以上。相对荧光定量PCR分析表明，plbHLH3在黄牡丹和紫牡丹的不同组织中均有表达，在两者的花药，心皮和花瓣中的表达显著高于在萼片和叶片中的表达；plbHLH3在紫牡丹的硬蕾期高丰度表达，而在黄牡丹的硬蕾期表达量最低，在其他4个时期的表达量显著或极显著高于在硬蕾期的表达量。本研究推测PlbHLH3参与黄牡丹花色素苷合成的调控作用，为今后深入探讨黄牡丹花色形成机制奠定理论基础。

黄牡丹PlWDR3和PlWDR18转录因子基因的克隆与表达

以云南野生黄牡丹为试验材料,根据已构建的云南野生黄牡丹花瓣转录组数据库提供的WDR40蛋白的Unigene筛选得到19个与花色素合成相关的WDR40蛋白同源性高的Unigene序列,命名为PlWDR1~19.通过氨基酸序列比较和系统进化树分析,发现PlWDR3和PlWDR18可能参与调控黄牡丹的花色素合成。PlWDR3的ORF包含1个1 032bp的开放阅读框,编码1个344个氨基酸的蛋白,与苹果MdTTG1的亲缘关系最近,相似性达83.29%;PlWDR18的ORF包含1个1 035bp的开放阅读框,编码1个345个氨基酸的蛋白,与葡萄VvWDR2相似性最高,达93.77%。相对荧光定量PCR分析表明,PlWDR3在黄牡丹和紫牡丹的不同时期的表达模式基本相似,在黄牡丹和紫牡丹圆桃期表达量最高,在初开期表达量最低;PlWDR18在黄牡丹花发育初期呈上升趋势,在透色期达到最高峰,然后下降,在初开期达到最小值;在紫牡丹花发育初期亦呈上升趋势,在圆桃期达到最大值,然后逐渐下降,在盛开期降到最小值。PlWDR18在黄牡丹和紫牡丹花的各个发育时期的表达量均高于PlWDR3的表达量。推测PlWDR3和PlWDR18参与黄牡丹花色形成的调控,为今后深入探讨黄牡丹花色形成机制奠定基础。

芒果LAR基因的克隆及其表达分析

无色花青素还原酶(leucoanthocyantin reductase,简称LAR)基因是植物原花色素的一个关键基因。本研究根据已经报道的LAR基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE和5'RACE方法,从芒果(Mangifera indica)果实中克隆得到1个LAR基因,其全长c DNA序列为1 221 bp。该基因开放阅读框为1 059 bp,编码352个氨基酸,等电点为5.78,分子质量为38.38 ku。利用生物信息学在线分析软件对该蛋白组成成分、疏水性/亲水性、二级结构、功能结构域以及三级结构进行预测和分析。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与棉花、葡萄、蓝莓、柿等具有较近的亲缘关系;对不同芒果品种的LAR基因的表达进行分析发现,绿色的桂七品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。

三色堇DFR基因的克隆及表达分析

从三色堇花瓣中克隆了1个花色素合成结构基因的全长c DNA,命名为Vw DFR。Vw DFR c DNA全长为1 340 bp,编码347个氨基酸组成的蛋白,与胡杨的DFR序列具有较高的序列一致性。Vw DFR蛋白含有典型的植物DFR蛋白的保守功能结构域,属于SDR超基因蛋白家族成员。Vw DFR基因在三色堇不同组织中的表达存在明显差异,在初花期的花瓣中表达量最高,且色斑区高于非色斑区。结果说明,Vw DFR可能与三色堇花色形成有关。此结果为深入研究三色堇花色形成奠定了基础。

新疆红肉苹果发育期间花青素代谢的研究

以新疆红肉苹果为试材,研究其生长发育过程中果肉花青素合成代谢的变化。结果表明：新疆红肉苹果果肉中的花青素含量从5月18日~6月11日逐渐减少,从7月5日~7月29日缓慢增长;在成熟的果实中,果肉花青素的含量是0.36 mg·g-1FW,高于普通品种的苹果,说明新疆红肉苹果是潜在的、良好的花青素来源;在新疆红肉苹果中,可溶性糖含量与类胡萝卜素含量呈显著负相关（R=-0.75）,花青素含量与类胡萝卜素含量呈显著正相关（R=0.79）,花青素含量与苯丙氨酸解氨酶（PAL）、花色素合成酶（ANS）之间没有明显的相关性,显示可能存在一些消耗花青素的途径。

脱落酸和吡效隆对荔枝果皮着色的影响

【目的】研究脱落酸(ABA)和吡效隆(CPPU)对荔枝果皮花色素苷生物合成及着色的影响,探索ABA调控荔枝果实花色素苷合成的分子机制。【方法】以‘桂味’荔枝为试材,喷施ABA和CPPU后,对果皮色泽、色素含量和花色素苷合成相关结构基因的表达规律进行分析。【结果】荔枝果实着色过程中,叶绿素含量降低,花色素苷含量增加,色度角逐渐降低;喷施ABA促进了花色素苷的积累,加速了叶绿素含量和色度角的降低,而CPPU则起了相反的作用;从花色素苷生物合成各基因的表达情况来看,对照果皮7个参试的结构基因均在果实成熟着色期间表达量逐步增加,而只有LcUFGT对ABA和CPPU两种生长调节剂的反应与果皮花色苷的积累趋势高度吻合,即ABA增加了LcUFGT的表达量,而CPPU明显抑制了LcUFGT的表达。【结论】ABA通过上调LcUFGT基因促进了荔枝果皮花色素苷的积累,加速了着色进程;而CPPU通过抑制LcUFGT基因的表达减缓了荔枝果皮花色素苷的合成,从而延缓荔枝果实着色;ABA参与了荔枝果皮中花色素苷生物合成调控,CPPU可能通过拮抗ABA影响花色苷的合成。

二氢黄酮醇4-还原酶的生物信息学分析

花色素苷是影响花色的主要色素,DFR是花色素苷合成的关键酶。采用生物信息学的方法分析已经在Gen-Bank上注册的拟南芥、金鱼草、兰花、山茶、番茄、水稻、矮牵牛和玉米等植物的DFR核酸及相应氨基酸序列,并对其理化性质、生化功能、系统发育关系和结构特征等进行预测。结果表明,金鱼草和山茶DFR定位于叶绿体,矮牵牛DFR定位于线粒体,山茶和矮牵牛DFR都是跨膜蛋白。DFR拥有一个NADB_Rossmann superfamily保守结构域和coiled-coil结构;所构建的DFR基因系统发育关系与形态学上的物种发育关系基本吻合;α-螺旋和无规则卷曲是DFR的主要二级结构元件;DFR的空间结构分为两个部分,松散C-末端和致密球状结构。

利用Gateway技术快速构建棉花GhANS基因植物表达载体

【目的】为了进一步探讨GhANS(花色素合成酶)基因的上调表达对彩色棉纤维色素合成的影响,构建了棉花GhANS基因的植物表达载体。【方法】利用Gateway技术的同源重组原理,将GhANS基因通过BP反应和LR反应分别重组到植物过表达载体pGWB17与干扰表达载体pANDA35HK中。【结果】经PCR和酶切鉴定,PCR扩增片段与酶切片段大小与预期结果相一致。【结论】基于Gateway技术的棉花GhANS基因的过表达载体和干扰表达载体已构建成功,为进一步研究该基因的功能及棉花的遗传转化奠定了基础。

’禾荔’优质晚熟突变体’GLL-1’类黄酮糖基转移酶基因LcUFGT的克隆与表达分析

’GLL-1’为’禾荔’中选育出的一个优质晚熟芽变新种质。为探讨’GLL-1’果实成熟期延迟的遗传基础,该研究以’禾荔’和’GLL-1’为实验材料,克隆花色素苷合成途径结构基因LcUFGT,并对其进行生物信息学预测及分析,同时通过qRT-PCR对LcUFGT基因在果实发育不同阶段的表达进行研究,分析LcUFGT的表达对突变体果实发育速度的影响。结果表明:(1)LcUFGT基因ORF长1359 bp,编码453个氨基酸,推测蛋白质分子量约为50.16 kD。(2)序列比对发现所编码蛋白与’禾荔’等荔枝品种高度保守,在蛋白的C端具有PSPG盒。(3)在果实发育成熟进程中,’禾荔’和’GLL-1’果皮逐渐退绿转红,两者LcUFGT基因的表达量都呈先上升后下降的表达趋势,然而,’禾荔’LcUFGT基因的表达量在花后56 d显著增加,突变体’GLL-1’LcUFGT基因的表达量在花后67 d显著增加,LcUFGT基因在突变体’GLL-1’中显著上升表达的时间比’禾荔’延迟,且与果实发育延迟基本一致。以上结果表明,LcUFGT基因在荔枝果皮着色过程中发挥重要作用,是果实着色的关键基因之一,突变体’GLL-1’中的延迟表达是引起突变体晚熟的原因之一。

彩叶植物呈色机理及其育种研究进展

近年来,彩叶植物因其亮丽的色彩而备受关注,越来越广泛地应用于园林绿化。但目前以改变叶片颜色、培育新的彩叶植物为目的的研究报道非常少,多数集中于研究模式植物花色素苷生物合成途径中结构基因和转录因子的功能。作者在综述彩叶植物呈色机理和影响因素的基础上,提出异源超表达花青素生物合成途径特异转录因子是培育彩叶植物的最有效途径。

马铃薯GAUT基因家族的全基因组鉴定及表达分析

半乳糖醛酸转移酶(GAUT)是一种参与催化糖基化反应的酶类,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。本研究鉴定了马铃薯GAUT家族成员,并对其理化性质、染色体定位、基因结构、保守蛋白结构域、基因重复事件和表达模式进行了分析。结果表明,鉴定到的41个GAUT家族成员(StGAUT),不均匀的分布在10条染色体上。根据基因的结构和系统发育蛋白特征,将41个StGAUT分为4个亚组。共线性分析表明,StGAUT基因家族存在12对片段重复基因,均在纯化选择下进化。通过对马铃薯双单倍体(DM)的不同组织部位和非生物胁迫下的RNA-seq数据进行分析,筛选出了组织特异性表达及响应非生物胁迫的StGAUT基因。此外,进一步对不同四倍体栽培种彩色马铃薯的薯皮和薯肉进行RNA-seq测序和分析,获得了可能参与花色素苷生物合成的StGAUT基因。本研究结果为进一步阐明StGAUT基因在马铃薯中的功能提供了有价值的信息。