拟南芥蔗糖合酶基因合成、重组表达及其在酶催化合成莱鲍迪甙A中的初步应用

本研究采用两步PCR的方法,合成拟南芥蔗糖合酶At SUS1的编码基因,并将其亚克隆到携带糖基转移酶UGT76G1基因的表达质粒p ET28a-UGT上,构建了双酶共表达质粒p EUGT-SUS。将质粒p EUGT-SUS转化到大肠杆菌Rossetta(DE3)中,在自诱导培养基中培养12 h,收集细胞超声破碎取其上清液为粗酶液用于催化甜菊甙合成莱鲍迪甙A的反应,结果确定重组酶At SUS1获得了活性表达,在双酶反应体系中,蔗糖和UDP在At SUS1作用下生成UDP-葡萄糖,供给UGT76G1所催化的糖基转移反应。考察了UDP初始浓度、反应pH、温度及反应时间对酶催化RA甙合成的影响。当UDP初始浓度为0.01 mmol/L,pH7.2和35℃反应条件下,反应12 h,10 g/L甜菊甙转化为莱鲍迪甙A的收率最高可达56.2%。为建立高效、经济的合成莱鲍迪甙A的酶催化工艺奠定了基础。

β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究

β-半乳糖苷酶的研究进展β-半乳糖苷酶来源及作用机理。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)普遍存在于动物(幼小动物的肠中)、植物(杏、苹果等)及微生物(细菌、霉菌等)中,能够将乳糖水解为葡萄糖及半乳糖供生物体代谢使用。在生物体体内,β-半乳糖苷酶是由Lac Z基因编码翻译而成的蛋白质酶类,通过提取动物、植物及微生物中的乳糖酶蛋白。

金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素含量及催化酶基因mRNA表达分析

旨在探明金龟子绿僵菌发酵液中苦马豆素含量及与苦马豆素生物合成有关的催化酶基因mRNA表达的关系,将金龟子绿僵菌接种于察氏培养基进行发酵培养,运用Q Exactive高分辨质谱仪检测培养第1、3、5、7天发酵液中苦马豆素的含量,采用qRT-PCR法检测培养第1、3、5、7天发酵液中苦马豆素生物合成通路上的催化酶基因SwnA、SwnH1、SwnH2、SwnK、SwnN、SwnR和SwnT的mRNA转录水平。结果显示,根据苦马豆素质量浓度和峰面积的变化测算出回归方程为y=31302.5x-45910.5(R2=0.9967),在培养第3天发酵液中苦马豆素含量最高为174.014μg·mg^-1;SwnA、SwnH1、SwnH2、SwnK、SwnN、SwnR和SwnT基因在不同发酵时期mRNA表达差异较大,其中SwnR基因mRNA表达与发酵液中苦马豆素含量变化相一致,而SwnH2基因mRNA表达与发酵液中苦马豆素含量变化相反。结果表明,金龟子绿僵菌SwnR基因mRNA表达与苦马豆素合成关系密切,可为后续开展苦马豆素微生物发酵工艺及其生物合成通路研究提供重要参考。

利用花粉管通道法将查尔酮合酶基因导入仙客来

查尔酮合酶(chalconesynthase-A,CHSA)是花色素合成途径中的一个关键酶,它在植物中表达的量可能影响花的颜色。本项目从矮牵牛(Petuniahybrida)特定发育阶段的花瓣的cDNA中,克隆到查尔酮合酶基因CHSA,插入到含有花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子的植物中间表达载体pBI121和pWM101中,首次通过原位生殖系统导入法(具体采用花粉管通道法)转化仙客来,成功地得到4400余粒仙客来转化种子,8株白花植株的个别花瓣出现了黄斑或略显黄色,甚至个别花瓣变成了黄色花瓣;3株白花植株的个别花瓣一半变成了桃红色(二乔),甚至整个花朵完全变成了桃红色。转基因仙客来经PCR检测呈阳性。

生物催化技术研究现状和发展趋势

生物催化技术是当今国际科技发展的热点,将继信息技术后引领新一轮的全球科技革命。文章介绍了近年来国内外生物催化技术的最新研究进展和发展趋势,包括生物催化剂的发现与改造、生物催化机理、生物合成反应的设计与调控、生物催化系统的设计和构建,以及生物催化技术的工业应用实例等。

NADP(H)相关的体外合成乳酸途径构建以及性质研究

活体细胞体内代谢途径调控机制复杂,若能将目的代谢途径移到胞外,则能进行直观研究。选用嗜热酶来源的10条基因,构建一个能实现自我能量ATP和辅酶NADP(H)循环平衡,葡萄糖代谢生成乳酸的体外合成途径。对该途径初步研究表明,最适反应p H7.0,最适反应温度50℃,该条件下添加少量的辅酶NADP+,8 h内能将12.4 g的葡萄糖转化生成9.5 g的乳酸。

化学品生物合成专刊序言

以酶及微生物细胞催化剂结合工程学方法将廉价、废弃原料进行高效生物转化可实现化学品的可持续生产。近年来,合成生物学、系统生物学及酶工程等技术的快速发展大大推动了化学品的可持续生物制造,既实现了多种新型化学品的生物合成,又显著提高化学品的生物合成效率。为展示化学品生物合成的最新进展并促进绿色生物制造的发展,《生物工程学报》特组织出版化学品生物合成专刊,从酶催化与生物合成机制、微生物细胞合成、一碳生物炼制以及关键核心技术等方面,介绍化学品生物合成的最新前沿、挑战以及潜在解决方案。

稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因细胞株的建立

目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株。方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选以获得单细胞抗性克隆并在传代过程中能稳定表达荧光素酶活性;检测细胞荧光素酶表达与细胞数量相关性;PCR检测稳定细胞株基因组已整合的插入片段;刺激因子刺激6h,检测稳定细胞株的反应性。结果:成功构建PGL4.19-GCLC-LUC;构建的稳定细胞株能稳定地表达荧光素酶,且与细胞数量正相关;PCR检测稳定细胞株目的片段稳定整合基因组;TNF-α刺激后,能使荧光素酶活性上升,差异有统计学意义(P<0.05);Rapamycin,GSH-EE刺激后,荧光素酶活性显著下降(P<0.05)。结论:成功构建稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因的细胞株,将为高通量药物筛选以及进一步研究GCLC基因的转录调控提供重要的细胞研究手段。

中国酶工程的兴旺与崛起

酶工程是生物工程的重要组成部分,工业生物催化技术被认为是继医药、农业之后的第三个浪潮。在25年中,中国在酶工程领域研究中取得很大进展,本综述集中介绍在中国酶工程会议上,酶的基因工程、酶的蛋白质工程、生物合成、微生物转化和生物传感器方面的成果和我国酶制剂工业的进展。

天然产物生物合成途径中的“隐藏”反应

天然产物生物合成途径中的"隐藏"的修饰反应有着新颖的酶催化机制和特殊的生物学意义,文章概述了几种不同类型的隐藏反应方式,包括卤化、甲酯化、氨基酰化、脂肪酰化和磷酸化5类。分析并总结"隐藏"的修饰反应对于我们认识天然产物生物合成途径的复杂性和多样性,推动天然产物生物合成领域的研究具有重要意义。同时也对新酶学机制的发现和利用基因工程手段来改造新药打下良好的基础。

真菌聚酮化合物生物合成研究进展

具有广泛生物活性的真菌聚酮化合物因具有复杂的化学结构,其生物合成途径一般包含多样且新颖的酶催化反应。文中主要综述了2013-2016年来源于还原性聚酮合成酶(HR-PKSs)、非还原性聚酮合成酶(NR-PKSs)、聚酮-非核糖体多肽合成酶(PKS-NRPSs)和还原性-非还原性聚酮合成酶(HR-NR PKSs)杂合型等四大类型的真菌聚酮类化合物的生物合成研究进展。众多真菌聚酮类化合物生物机理的阐明,为未来新型真菌聚酮类天然产物生物合成基因簇的挖掘、新结构化合物的发现及其类似物的研究提供了方向和理论基础。

植物花斑形成分子机理研究进展

综述了近年来对植物花斑形成分子机理的研究进展,总结了与花斑形成相关的花色素合成催化酶基因与调节基因,探讨了转座子、启动子、RNA干扰、甲基化、病毒等对花斑形成的作用,并提出了花斑形成分子机理推测模型图,以期为进一步认识花斑形成的分子机理,开展花斑育种奠定理论基础。