桑树花青素合酶基因的克隆与信息学分析

花青素合酶ANS是花青素合成过程中的一个关键限速酶。本文利用同源克隆、RT-PCR从桑椹中克隆出花青素合酶(MaANS)基因,并进行生物信息学分析和组织特异性表达分析。通过染色体步移法获得的MaANS基因的5′端和3′端,获得基因全长1535bp,由2个外显子和1个内含子组成,包含完整CDS区域为1077bp,编码358个氨基酸,与来源于草莓、甘薯、苹果、沙梨的ANS基因同源性均达到80%以上。MaANS编码的蛋白质属于2-酮戊二酸双加氧酶家族。MaANS在进化树中的位置与草莓最近,与苹果、沙梨次之。组织表达分析表明,MaANS基因在幼叶和成熟果实中高水平表达,表明该基因的表达具有组织特异性,为研究桑树果色的形成原因和表达调控奠定了基础。

山楂原花青素调节环氧合酶-2表达诱导Eca109食管癌细胞凋亡

探讨山楂原花青素(hawthorn procyanidins,HPC)通过磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase/serine threonine protein kinase,PI3K/Akt)信号通路调节环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表达,诱导Eca109食管癌细胞凋亡的分子机制。体外常规培养食管癌细胞株,配制25、50、100、200、300、400μg/m L不同质量浓度的HPC,CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测并计算不同质量浓度HPC在72 h内对Eca109食管癌细胞的抑制率,选取IC_(50)=250μg/m L作为HPC处理组剂量,并设对照组。Western blotting法检测Eca109细胞PI3K和Akt磷酸化程度、Caspase-3和COX-2蛋白表达水平,反转录聚合酶链式反应(reverse transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)检测Eca109细胞COX-2 m RNA表达水平,Annexin V-FITC/PI法检测0、12、24、36、48、72 h时HPC对Eca109食管癌细胞凋亡率的影响。结果表明:HPC处理组Eca109食管癌细胞PI3K、Akt磷酸化程度随着处理时间延长逐渐降低(P<0.01),在48 h时活性最低,HPC处理组Eca109食管癌细胞COX-2 m RNA的表达量与对照组比较明显降低(P<0.01)。在HPC的作用下,Eca109食管癌细胞Caspase-3蛋白表达量在48、72 h时最强(P<0.01),COX-2蛋白表达量在72 h时最低(P<0.01)。Eca109食管癌细胞凋亡率随着时间的延长越来越高,在72 h时达到63.54%(P<0.01)。HPC可通过PI3K/Akt途径下调COX-2表达,从而诱导Eca109食管癌细胞凋亡。

莲房原花青素对衰老小鼠脑组织中一氧化氮及一氧化氮合酶的影响

目的探讨莲房原花青素(lotus seedpod procyanidins,LSPC)对D-半乳糖衰老小鼠脑组织抗氧化系统的影响。方法60只昆明小鼠随机均分为5组:对照组(A组)、衰老模型组(B组)、LSPC低剂量组(C组,15mg/ml)、LSPC中剂量组(D组,30mg/ml)和LSPC高剂量组(E组,60mg/ml)。采用D-半乳糖建立小鼠衰老模型,化学比色法检测脑组织中总一氧化氮合酶(NOS)和神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)活性,一氧化氮(nitric oxide,NO)含量。用免疫组化法检测nNOS在脑组织中的表达。结果与B组相比较,C、D、E组LSPC能明显减少NO含量(P<0.05);D、E组LSPC不仅能明显降低总NOS和nNOS活性(P<0.01,P<0.05),且能减少nNOS在脑组织中的表达。结论LSPC对D-半乳糖所致脑衰老具有明显的保护作用。

原花青素对脑缺血再灌注小鼠脑组织细胞因子、一氧化氮合酶和血脑屏障的影响

目的探讨葡萄籽原花青素对缺血再灌注小鼠脑组织细胞因子、一氧化氮合酶和血脑屏障通透性的影响。方法采用夹闭小鼠双侧颈总动脉30 min再灌注72 h的脑缺血再灌注模型,并于双侧颈总动脉夹闭时及再灌注后每隔24 h分别腹腔注射蒸馏水、葡萄籽原花青素(10、20及40 mg/kg)和尼莫地平(2 mg/kg)。在处死动物前1 h经尾静脉注射2%伊文思蓝,采用ABC-ELISA法检测脑组织中白细胞介素1β和白细胞介素10含量,采用分光光度法检测脑组织中一氧化氮合酶活性及伊文思蓝含量。同时光镜观察小鼠海马CA1区脑组织的病理变化。结果与假手术组相比,缺血再灌注组脑组织中白细胞介素1β含量、一氧化氮合酶活性及伊文思蓝含量明显增高(P<0.01),而白细胞介素10含量降低,但无统计学意义。与缺血再灌注组相比,葡萄籽原花青素及尼莫地平治疗组脑组织中白细胞介素1β含量、一氧化氮合酶活性及伊文思蓝含量有不同程度的降低,而白细胞介素10含量有不同程度的升高。病理学组织检查发现,葡萄籽原花青素能改善脑缺血再灌注所造成的神经细胞损伤,减少神经细胞坏死。结论葡萄籽原花青素可能通过降低小鼠脑缺血再灌注时一氧化氮合酶活性和促炎因子白细胞介素1β含量,提高抗炎因子白细胞介素10含量进而降低血脑屏障的通透性而发挥脑保护作用。

原花青素对白介素-1β诱导的A549细胞环氧合酶-2mRNA转录的抑制作用

目的研究原花青素对白介素-1β(IL-1β)诱导的人肺癌细胞A549中环氧合酶-2(COX-2)mRNA转录的抑制机制。方法采用RT-PCR法测定原花青素对IL-1β诱导的A549细胞中COX-2 mRNA转录的影响,采用Western blot和免疫组化法考察原花青素对IL-1β诱导的A549细胞核转录因子κB(NF-κB)亚基p65(NF-κB/p65)及NF-κB抑制性蛋白(I-κB)表达的抑制作用。结果原花青素对A549细胞中COX-2 mRNA的转录有较强抑制作用,抑制NF-κB/p65的表达及I-κB的降解。结论原花青素可能是通过抑制NF-κB/p65的表达及I-κB的降解而抑制COX-2mRNA的转录。

原花青素对IL-1β诱导的A549细胞环氧合酶-2启动子活性的影响

以白介素-1β(IL-1β)诱导的人肺癌细胞A549为模型,探讨原花青素(PC)对环氧合酶-2(COX-2)启动子活性的影响。用含有完整和NF-κB结合位点突变的COX-2启动子的的荧光素酶表达载体pGL 3质粒,转染A549细胞,加原花青素(20 mg/L)培养,检测COX-2基因5’调控区相对转录活性;RT-PCR检测细胞COX-2 mRNA的表达。结果发现NF-κB结合位点突变的COX-2基因转录活性极大地降低,原花青素可以显著降低完整的COX-2启动子转录活性,降低A549细胞中COX-2 mRNA的表达。

原花青素对脂多糖诱导的环氧合酶-2表达的抑制作用

以脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞为模型,研究原花青素对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞中环氧合酶-2(COX-2)mRNA转录的抑制机制。采用RT-PCR法测定原花青素对LPS诱导的RAW264.7细胞中COX-2mRNA转录的影响,采用Western blot和免疫组化法考察原花青素对LPS诱导的RAW264.7细胞核转录因子κB(NF-κB)亚基p65(NF-κB/p65)及NF-κB结合蛋白(I-κB)表达的影响。结果发现LPS处理RAW264.7细胞可以明显上调COX-2 mRNA的表达,同时降低胞质蛋白I-κB的表达水平,增加NF-κB的水平。原花青素对RAW264.7细胞中COX-2 mRNA的转录有较强抑制作用,抑制NF-κB/p65的表达及I-κB的降解,原花青素可能是通过抑制NF-κB/p65的表达及I-κB/p65的降解而抑制COX-2的表达。

蓝粒小麦花青素合成途径中的查尔酮合酶基因和类黄酮3＇5＇-羟化酶基因3＇末端的克隆和表达分析

采用RT-PCR和RACE方法从蓝粒小麦(Triticum aestivum L.×Thinopyrum ponticum(Podp.)Z.W.Liu et R.R.-C.Wang)发育种子中克隆到两个查尔酮合酶基因(TaCHS.tl，TaCHS．wl)，分别编码394个氨基酸，二者核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为96．0％和98．9％；而且克隆到一个类黄酮3'5’．羟化酶基因(F3'5'H)3’-末端。分别从长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum(Podp．)Z．W．Liu et R．R．-C．Wang)、蓝粒小麦、白粒小麦和中国春基因组中分离到查尔酮合酶基因(CHS)的全长序列(ThpCHS.tg TaCHS．wg，TaCHS．csg)，它们的核苷酸序列之间具有很高的同源性，且均含有一个内含子(intron)，序列差异主要在内含子。通过DNA序列比较，发现一个CHS与亲本之一的长穗偃麦草基因组同源性达100％，一个CHS与另一白粒亲本基因组同源性达99％，表明来自于父、母本的CHS在蓝粒发育的种子中均表达。Southerm杂交结果表明CHS在小麦中的拷贝数至少有4个，不同颜色的蓝粒小麦、白粒小麦间拷贝数基本一致，但都与长穗偃麦草有差异，根据以上结果初步判定CHS在蓝粒小麦中属于一个多基因家族。Reverse Northern分析表明CHS在开花后15d发育的蓝粒小麦中具有较强的表达；花后21d F3'5'H和DFR的转录本积累显著高于CHS，基本上检测不到CHS的表达。这三个基因在蓝粒小麦中的表达顺序与其他植物花青素合成途径中的基因表达次序一致：ChS先于F3'5'H，F3'5'H先于DFR。实验还表明F3'5'H和DPR在幼叶中表达也较强，CHS仅在发育种子中表达，具有组织特异性。花后21d，F3’5’H在白粒、蓝粒小麦和中国春种子中均强烈表达，蓝粒小麦CHS和DFR转录本比白粒小麦多。因此，认为在蓝粒小麦中存在花青素生物合成途径，在蓝色色素形成过程中，该途径中的结构基因受到调节基因的调控。

桑树二氢黄酮醇-4-还原酶和花青素合酶基因在桑椹中的表达谱及其与花青素含量的关系

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)和花青素合酶(ANS)是植物花青素生物合成途径的2个重要酶类。从鲁桑品种育711号植株中克隆得到MmDFR和MmANS基因,生物信息学分析表明,MmDFR基因的ORF长度为1011 bp,编码336个氨基酸,预测蛋白质分子质量为3951 kD,等电点为534;MmANS基因ORF的长度为1077 bp,编码358个氨基酸,预测蛋白质分子质量为42.23 kD,等电点为5.25;MmDFR和MmANS蛋白的氨基酸序列有很高的保守性。qRT-PCR检测结果表明,MmDFR和MmANS在不同桑种质成熟桑椹中的表达丰度存在显著差异,在同一品种中随着果实成熟,基因的表达水平逐渐提高。结合对桑椹花青素含量的检测,表明桑椹花青素含量与MmDFR和MmANS基因的表达量呈正相关,推测MmDFR和MmANS在桑椹花青素合成途径中具正向调控作用。

原花青素对脂多糖诱导RAW264.7细胞COX-2酶活性、mRNA及蛋白表达的影响

目的 探讨原花青素对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞株RAW264 7细胞COX 2酶活性及蛋白表达的影响。方法 放射免疫法检测COX 2酶活性,RT PCR检测COX 2mRNA表达,Westernblotting检测COX 2蛋白表达。结果 原花青素( 0 8, 4和20mg·L-1 )不影响LPS诱导RAW264 7细胞COX 2酶活性,可下调LPS诱导RAW264 7细胞COX 2mRNA表达;原花青素( 4和20mg·L-1 )下调LPS诱导RAW264.7细胞COX-2蛋白表达。结论 原花青素不影响LPS诱导RAW264.7细胞COX 2酶活性,但对LPS诱导RAW264 7细胞COX 2mRNA及蛋白表达抑制作用明显。

转查尔酮合酶基因对烟草花色及花器官的影响

花色是重要的园艺性状,一直是育种工作者苦苦追求的目标。利用植物基因工程技术可定向改良花色。根据已知的CHS序列(序列号M20308.),用PCR方法从拟南芥中克隆CHS基因,并分别将其以正向、反向插入到真核表达载体pBI121,在农杆菌介导下用叶盘转化法转化烟草。对转基因烟草进行检测,结果表明,转基因烟草的花色变淡、花青素含量降低;叶片颜色变浅、叶绿素含量降低。转基因烟草花的形态也发生了明显变异。

原花青素对D-半乳糖复合三氯化铝诱导大鼠主动脉损伤的保护作用及机制

目的:探讨原花青素对D-半乳糖(D-gal)复合三氯化铝(AlCl3)诱导大鼠主动脉损伤的保护作用及可能机制。方法:采用D-半乳糖腹腔注射(i.p.)180mg·kg-1·d-1联合三氯化铝灌胃(i.g.)15mg·kg-1·d-1建立主动脉损伤大鼠模型,12周后将40只大鼠随机分为空白对照组(NS i.p.,NS i.g.),主动脉损伤组(D-gal i.p.+AlCl3i.g.),原花青素低、高剂量组(PC 20、40mg/kg;D-gal i.p.+AlCl3i.g.),维生素E组(VitE 10mg/kg;D-gal i.p.+AlCl3i.g.),每组8只。每日灌胃给药一次,连续8周。于末次给药后,尾袖法测量大鼠尾动脉血压;离体灌流法观察主动脉环对乙酰胆碱的舒张反应;HE染色观察主动脉病理变化;化学比色法测定血清总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢(H2O2)以及NO含量;免疫组化法观察主动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达。结果:与模型组相比,随着原花青素剂量的增加,大鼠血压逐渐降低,主动脉内皮依赖性舒张功能逐渐增强,主动脉病理损伤得到不同程度的改善;血清中总抗氧化能力和NO含量逐渐增高,H2O2含量逐渐降低;主动脉eNOS蛋白表达逐渐增加。结论:原花青素可明显降低主动脉血压,增强主动脉环内皮依赖性舒张反应,减轻主动脉病理损伤,增高血清NO水平,上调主动脉eNOS蛋白的表达,对D-半乳糖复合三氯化铝诱导的大鼠主动脉损伤有一定保护作用。

Generation of White Flowers by Transgenic Approach

Flower color is one of the most attractive characteristics in ornamental plants,contributing to the major value in the floricultural market. Anthocyanins are a major colored class of flavonoids that are responsible for the pink,

百脉根花青素合酶基因(LcANS)的克隆及表达分析

花青素合成酶是牧草百脉根中原花青素合成途径的关键酶。在分析百脉根转录组基础上,采用RT-PCR从百脉根中首次克隆到花青素合成酶基因的全长编码c DNA序列,命名为Lc ANS。Lc ANS全长c DNA为1 098 bp,包含一个1 068 bp的开放读码框,编码355个氨基酸。生物信息学分析显示Lc ANS编码蛋白具有植物ANS典型的2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶结构域,与豆科的红豆草、苜蓿、大豆等植物中同源ANS具有较高的序列一致性。Lc ANS蛋白定位于细胞质中,没有信号肽和跨膜结构域。实时荧光定量PCR结果表明,Lc ANS基因在百脉根不同组织器官中差异表达,在果荚和花中表达量最高,同时又可以响应ABA和低温的诱导。

莲原花青素在油脂体系中的抗氧化作用

【目的】研究莲原花青素在油脂体系中的抗氧化作用,为开发新型健康的天然食品抗氧化剂提供理论依据。【方法】通过添加不同浓度的原花青素以及将原花青素和卵磷脂等抗氧化剂复配,研究原花青素在油酸和各类动植物油脂中的抗氧化作用。采用亚油酸氧化体系表征原花青素对脂肪氧合酶活性的抑制。【结果】原花青素对油酸和动植物油脂均显示不同程度的抗氧化效果,对试验所用的油脂抗氧化效果依次为:茶籽油>猪油>棉籽油>豆油,其中茶籽油的氧化诱导期延长了2.2倍;并且卵磷脂和维生素E对原花青素有很好的增效作用,尤其与维生素E的复配,能将油酸的诱导期延长14.7倍,猪油的诱导期延长3.6倍。在抑制脂肪氧合酶活性方面,原花青素与茶多酚有着相同的效果。【结论】原花青素对油脂体系有着优良的抗氧化作用,对油脂氧化抑制效果显著。

花青素抗炎机制的研究进展

花青素是一种存在于植物性食物中具有生物活性的化合物,具有较强的调节炎症的能力,有助于防止神经元疾病、心血管疾病、糖尿病等疾病的发生。花青素能通过抑制促炎细胞因子、细胞黏附分子、氧自由基的表达,影响核转录因子κB及丝裂原活化蛋白激酶通路,介导一氧化氮、环氧合酶2的表达等发挥抗炎作用。其作为有效抗炎且安全的天然物质,具有广阔的研究前景。

葡萄籽原花青素对小鼠脑缺血、再灌注及缺氧性损伤的影响

目的:研究葡萄籽原花青素(GSP)对小鼠脑缺血、再灌注损伤及常压缺氧的影响。方法:采用小鼠常压耐缺氧实验和结扎双侧颈总动脉引起急性不完全脑缺血实验,观察GSP对缺氧(血)小鼠存活时间及耗氧量的影响;采用夹闭小鼠双侧颈总动脉30min再灌注72h的脑缺血再灌注模型,观察GSP对脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、一氧化氮合酶(NOS)活性,总抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)含量的影响。结果:GSP能剂量依赖性地延长常压缺氧及脑缺血小鼠的存活时间,降低耗氧量;并能提高缺血再灌注小鼠脑组织中SOD、CAT活性,提高机体总抗氧化能力,降低NOS活性及MDA含量。结论:GSP对小鼠脑缺血、再灌注及缺氧性损伤有明显的保护作用,其作用机制可能与其抗自由基、提高机体抗氧化能力,以及降低NOS活性有关。

原花青素抑制哮喘小鼠气道炎症及气道高反应性

目的:探讨葡萄籽提取物原花青素对急性哮喘模型小鼠气道炎症和气道高反应的作用及其机制。方法:选择32只8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠,随机平均分成4组:对照组、哮喘组、布地奈德组和原花青素组。卵白蛋白(OVA)致敏和激发制作哮喘模型。小鼠末次激发24 h后,检测小鼠气道阻力;苏木精-伊红(HE)染色观察气道炎性细胞浸润;过碘酸雪夫(PAS)染色观察杯状细胞增生、气道黏液分泌;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清总IgE和支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素(IL)-4和干扰素(INF)-γ;免疫印迹(Western blot)测定肺组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平。结果:与正常组相比,哮喘组气道阻力、气道炎症、BALF中细胞计数和嗜酸性粒细胞分类计数、IL-4、血清总IgE以及肺内iNOS蛋白表达明显增高(P<0.01),而BALF中INF-γ明显降低(P<0.01);与哮喘组相比,除INF-γ升高外,原花青素治疗组和布地奈德组各项指标均降低(P<0.05)。结论:原花青素通过减少肺内iNOS的表达而减轻哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性,具有潜在的临床应用前景。

原花青素脑保护作用的研究

目的探讨原花青素对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用及机制。方法 80只♂大鼠随机分成5组,假手术组、模型组和原花青素低、中、高剂量(50、100、200 mg.kg-1)组。采用改良的线栓法制备大鼠局灶性脑缺血(2 h)/再灌注(24 h)损伤模型,原花青素各组于缺血前30 min和缺血后2 h腹腔注射原花青素溶液,假手术组和模型组给与等体积的NS。再灌注24 h后,测定脑片中ASIC1a的表达及MPO和iNOS活性。结果原花青素能降低缺血区脑组织中ASIC1a的表达,并且可降低脑组织中MPO和iNOS的活性。结论原花青素对大鼠脑缺血/再灌注损伤有保护作用,其机制可能与抗炎、抗氧化以及抑制ASIC1a的表达有关。

原花青素对阿尔茨海默病大鼠学习记忆功能及海马nNOS表达的影响

目的:探讨原花青素(PC)对阿尔茨海默病(AD)大鼠的学习记忆功能及海马神经元型—氧化氮合酶(nNOS)表达的影响。方法:选用正常SD大鼠,首先建立空白对照组(NS ip,NS ig)15只,其余腹腔注射D-半乳糖[D-gal,180 mg/(kg·d)]联合灌胃三氯化铝[AlCl3,15 mg/(kg·d)]12周后,通过Morris水迷宫行为学检测筛选造模成功大鼠,随机分为AD模型组(NS ip,D-gal ip+AlCl3ig),原花青素高剂量组(PC 40 mg/kg;D-gal ip+AlCl3ig),原花青素低剂量组(PC 10 mg/kg;D-gal ip+AlCl3ig),维生素E阳性对照组(VitE 10 mg/kg;D-gal ip+AlCl3ig),每组15只,继续给药8周后,Morris水迷宫法测试各组大鼠的学习记忆能力;尼氏染色观察大鼠海马神经元变化;海马匀浆检测其中NO的含量;免疫组化染色观察大鼠海马中神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达。结果:与正常对照组相比,AD模型大鼠学习记忆能力明显下降,逃避潜伏期明显延长(P<0.01),穿越平台次数明显减少(P<0.01),海马区的神经元细胞尼氏小体明显减少,海马匀浆中NO含量明显增加(P<0.01),nNOS的表达明显增加(P<0.01)。与AD模型组相比,原花青素组可明显改善AD大鼠的学习记忆功能,降低海马中nNOS表达及NO含量(P<0.01)。结论:原花青素可明显改善阿尔茨海默病大鼠的学习记忆功能,其机制可能与降低海马组织nNOS表达及NO含量有关。