桑树花青素还原酶基因MaANR的克隆和表达分析

花青素还原酶(ANR)是原花青素单体生物合成过程中的关键酶之一,对花青素在植物组织中的积累有重要调控作用。通过检索川桑(Morus notabilis)基因组数据库鉴定获得了ANR候选基因序列,并以人工四倍体果桑品种嘉陵30号的桑椹c DNA为模板克隆了ANR基因(Ma ANR),其CDS序列长1 014 bp,编码337个氨基酸残基。聚类分析结果表明Ma ANR与草莓、西洋梨的花青素还原酶Fa ANR和Pc ANR的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR检测Ma ANR在桑椹中的表达量最高,在桑树其他部位和组织中的表达量极低,在茎中几乎检测不到表达;Ma ANR在生长发育早期的桑椹中表达量较低,在快速生长过程的桑椹中高量表达,而在花青素大量合成的桑椹成熟时期表达量极低。初步推测Ma ANR可能是桑椹中花青素积累的重要负调控因子。

红花花青素还原酶基因ANR的克隆及表达分析

花青素还原酶(ANR)是类黄酮代谢途径下游合成原花青素的关键酶,对花青素含量有一定的负调控作用。为探索ANR基因在红花(Carthamus tinctorius L.)中的序列特征及其与红花花色的关系,采用反转录PCR方法从红花中克隆ANR基因,对其进行生物信息学和系统进化分析,并检测了其在不同花色红花品种的不同组织部位及不同花期的表达量。结果表明,CtANR最长开放阅读框(ORF)为1020 bp,编码339个氨基酸,分子量为37958.28,理论等电点为5.87,为不稳定的亲水性蛋白,属于NADB-Rossmann超家族,二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。CtANR和刺菜蓟ANR的同源性最高,为83.98%,与刺菜蓟ANR的亲缘关系最近,与梅花、欧洲甜樱桃ANR的亲缘关系较远,模体基序相差较大。定量分析表明,红色和白色红花品种中,CtANR基因都是在果球形成初期表达量最低,其次是根和茎中表达量较低,而在花中的表达量相对较高。在花发育的不同时期,红色红花品种中CtANR基因的表达呈现降低-升高-降低的趋势,而白色红花品种中CtANR基因的表达呈现降低-升高的趋势。在不同花色的红花品种中,CtANR基因的表达量在花发育的S1、S3和S5时期差异极显著(P<0.01),S4、苞片、根、叶中差异显著(P<0.05),其他时期与其他组织中差异不显著。本研究为解析红花类黄酮生物合成的分子机制及红花花色相关基因的研究提供了理论基础。

二氢黄酮醇-4-还原酶在花青素合成中的功能及调控研究进展

植物色素主要有花青素、类胡萝卜素和生物碱类色素三大类,其中花青素是决定大部分被子植物组织或器官颜色的重要色素。花青素通过类黄酮途径合成,该途径是生物学上研究较多且较为清楚的代谢途径之一。近年来的研究表明,在该途径中除了查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)和黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydrolase,F3H)起着关键作用外,二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)对花青素的合成也至关重要。DFR可催化3种二氢黄酮醇和2种黄烷酮生成5种不同的花青素前体,且DFR基因家族不同成员对各个底物的催化效率不同,因此它在一定程度上决定着植物中花青素的种类和含量,从而影响植物组织或器官的颜色。该文对近年来国内外有关DFR在花青素合成过程中的生物学功能与调控,包括DFR的特征、作用机制和系统进化以及环境、转录因子和一些结构基因与DFR的关系等方面的研究进展进行了综述,以期为DFR今后的研究和利用基因工程改变植物组织或器官的颜色提供理论依据。

茶树花青素还原酶基因在大肠杆菌中的表达及优化

茶树花青素还原酶是催化非酯型儿茶素EC和EGC合成的关键酶。采用RT-PCR技术,获得了茶树花青素还原酶基因的开放阅读框,它编码含337个氨基酸的蛋白质,推测分子量为37 kD,等电点为6.54;成功地将该基因重组到表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌rosetta中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度、氨苄青霉素浓度,纯化出目的蛋白。HPLC检测表明,目的蛋白具有ANR酶活性。

茶树花青素还原酶的酶学特性研究

茶树花青素还原酶(CsANR)作为原花青素生物合成途径中的关键酶,催化花青素为相应的2,3-顺式-黄烷-3-醇。为了研究该酶的酶学特性,本文采用原核表达及钴离子亲和柱纯化技术,表达并纯化出目的蛋白;重点对CsANR1酶学特性进行研究分析。结果表明,CsANR1的最适反应温度为40℃,最适pH值为6.5;对底物矢车菊色素的亲和力高于飞燕草色素。Cu2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+和Hg2+等金属离子对酶有抑制作用,存放15d后酶活下降50%。

甘肃红豆草无色花青素还原酶LAR基因的克隆和表达分析

以甘肃红豆草为材料,采用RT-PCR法克隆无色花青素还原酶LAR基因,分析该功能基因在甘肃红豆草不同器官表达的差异性。结果表明,克隆的甘肃红豆草LAR基因,与Gen Bank已报道LAR基因(登录号:HM152981)序列相似性达到98.34%,其ORF长为1089 bp,编码362个氨基酸残基;其编码的氨基酸序列与不同属豆科物种的相似性存在较大的差异。基因序列已注册到Gen Bank,序列登录号为KP013623。LAR基因在甘肃红豆草不同器官表达差异较大;其中叶中表达量最高,其次是花和果,茎中表达量最低,这与器官间缩合单宁含量的变化规律一致。推测其表达与甘肃红豆草缩合单宁器官间的积累差异有关。这些研究结果也为探索缩合单宁积累和表达调控的机制提供基础。

桑树二氢黄酮醇-4-还原酶和花青素合酶基因在桑椹中的表达谱及其与花青素含量的关系

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)和花青素合酶(ANS)是植物花青素生物合成途径的2个重要酶类。从鲁桑品种育711号植株中克隆得到MmDFR和MmANS基因,生物信息学分析表明,MmDFR基因的ORF长度为1011 bp,编码336个氨基酸,预测蛋白质分子质量为3951 kD,等电点为534;MmANS基因ORF的长度为1077 bp,编码358个氨基酸,预测蛋白质分子质量为42.23 kD,等电点为5.25;MmDFR和MmANS蛋白的氨基酸序列有很高的保守性。qRT-PCR检测结果表明,MmDFR和MmANS在不同桑种质成熟桑椹中的表达丰度存在显著差异,在同一品种中随着果实成熟,基因的表达水平逐渐提高。结合对桑椹花青素含量的检测,表明桑椹花青素含量与MmDFR和MmANS基因的表达量呈正相关,推测MmDFR和MmANS在桑椹花青素合成途径中具正向调控作用。

不同植物无色花青素还原酶及其基因的生物信息学分析

对9种不同植物的无色花青素还原酶及其基因进行生物信息学分析,探索该蛋白的结构并预测LAR的功能。通过生物信息学软件对Gen Bank中已经登录的不同植物LAR基因和氨基酸序列进行分析,对其组成成分、理化性质、翻译后修饰位点、功能域、二级结构、亚细胞定位、分子进化等进行预测和推断。结果表明,9种植物无色花青素还原酶基因全长在1.0~1.2 kb,编码342~391个氨基酸,不具有信号肽;9种植物LAR都具有蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-端肉豆蔻酰化位点,个别植物LAR具有N-端糖基化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点和c AMP和c GMP依赖蛋白激酶磷酸化位点;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;进化分析表明禾本科的玉米与其他科植物亲缘关系较远。

中国沙棘HrANR基因及黄酮类累积与抗旱的关系

花青素还原酶(anthocyanidin reductase,ANR)是合成黄酮类物质的关键酶之一,为明确其编码基因结构及干旱胁迫下的表达模式和黄酮类物质含量及二者之间的相关性,该文从中国沙棘转录组数据中筛选获得1个ANR基因,命名为HrANR基因。采用生物信息学软件对基因序列及编码蛋白进行分析,并对不同胁迫下各组织中HrANR基因的表达量和叶中黄酮类化合物含量进行相关性分析。结果表明:(1)中国沙棘HrANR基因ORF为1017 bp,编码338个氨基酸,为稳定的亲水性蛋白,其ANR同源蛋白具有明显的科属特性。(2)干旱胁迫下HrANR基因在中国沙棘根、茎、叶中均有表达,但表达趋势不同,其中在根中的表达呈先升高后降低再升高的趋势,在茎中呈持续下降的趋势,在叶中呈先升高后持续降低的趋势。(3)通过芦丁标准曲线获得不同胁迫程度下中国沙棘叶内黄酮类的含量,表明黄酮类含量呈先持续上升,随后略有下降,复水后上升至最高点的变化趋势,表明干旱胁迫初期叶黄酮类含量与干旱胁迫呈正相关,在严重胁迫下黄酮类含量与胁迫呈负相关。(4)叶和茎的HrANR基因表达量与黄酮类含量呈负相关(P_(叶)=-0.751,P_(茎)=-0.934),根中呈正相关(P_(根)=0.444)。综上表明,中国沙棘HrANR基因的表达及黄酮类含量变化与其抗旱性密切相关,其结果为中国沙棘抗旱机制的阐明提供了依据。

植物二氢黄酮醇4-还原酶基因的研究进展

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径的关键酶,在花色的修饰中起重要作用。我们简述了DFR基因及其调节基因的研究进展,构建的系统进化树体现了部分单子叶与双子叶植物间的亲缘关系与进化差异,阐述了DFR调控基因的调控机制及DFR基因的应用前景。

植物二氢黄酮醇-4-还原酶基因的研究进展

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花青素生物合成途径中的关键酶,在花色的修饰中起重要作用,目前,已从多种植物中分离得到。从DFR基因的结构和作用机制、底物特异性、时空表达模式及花色修饰等方面进行了概括和总结,为DFR基因的进一步研究和利用提供理论依据。

桑树花青素合成相关基因MaLAR和MaUGAT的克隆与表达分析

无色花青素还原酶(leucoanthocyanidin reductase,LAR)是催化无色花青素转化为儿茶素的一个关键酶,是植物类黄酮生物合成路径中的一个下游酶,可抑制无色花青素在花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)的催化下转化为花青素;花青素⁃3⁃O⁃葡萄糖苷⁃2⁃O⁃葡萄糖醛酸转移酶(cyanidin⁃3⁃O⁃glucoside 2⁃O⁃glucuronosyltransferase,UGAT)是植物花青素生物合成路径中一个关键酶,其催化花青素⁃3⁃O⁃葡萄糖苷转化为花青素3⁃O⁃(2⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖醛酸基)⁃β⁃D⁃葡萄糖苷,使得无色花青素最终转化为稳定的花色苷物质而累积在果实中。通过与川桑(Morus notabilis)基因组数据库进行比对鉴定到了MaLAR和MaUGAT基因,并以粤椹大10与和田白桑的桑椹cDNA为模板克隆了MaLAR和MaUGAT基因。聚类分析结果表明粤椹大10 MaLAR与甜樱桃(Prunus avium)亲缘关系较近,和田白桑MaLAR与川桑亲缘关系较近;粤椹大10 MaUGAT与和田白桑MaUGAT均与川桑亲缘关系较近,均属于蔷薇目。实时荧光定量PCR检测表明MaLAR在和田白桑桑椹S1—S3阶段的表达水平均高于粤椹大10;而MaUGAT则在粤椹大10桑椹S2—S3阶段中表达水平显著高于和田白桑。研究表明MaLAR在桑树花青素合成途径中可能起负调控作用,而MaUGAT在桑树花青素合成途径中可能起正调控作用。

葡萄籽原花青素提取物预灌胃对造影剂诱导糖尿病大鼠急性肾损伤的预防作用观察

目的观察葡萄籽原花青素提取物预灌胃对造影剂诱导糖尿病大鼠急性肾损伤的预防作用,并探讨可能作用机制。方法50只SD肥胖大鼠,腹腔注射1%链脲佐菌素(40 mg/kg),41只成功建成糖尿病大鼠模型,随机分为DM组8只、CM组9只、葡萄籽原花青素提取物低剂量组8只、中剂量组8只、高剂量组8只,另取10只肥胖大鼠为空白对照组(NC组),1 mL/kg腹腔注射柠檬酸缓冲液;低、中、高剂量组大鼠每日分别用50、250、500 mg/kg的葡萄籽原花青素提取物灌胃1次,连续3天,第3天灌胃24 h时尾静脉注射碘海醇(1.8 g I/kg);NC组、DM组、CM组大鼠每日用10 mL/kg生理盐水灌胃1次,第3天灌胃24 h时,NC组、DM组尾静脉注射5 ml/kg生理盐水;CM组尾静脉注射碘海醇(1.8 g I/kg)。末次给药48 h时各组大鼠断尾采血,检测血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN),采血后处死各组大鼠,取肾组织检测肾组织氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),采用原位缺口末端标记法测算各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数,采用Western Blotting法检测各组大鼠肾组织核因子E2相关因子2(Nrf2)-Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)通路相关醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素单加氧酶-1(HO-1)、Nrf2、Keap1蛋白。结果与NC组比较,CM组及低剂量组血清SCr、BUN水平高(P均<0.05)。与CM组比较,NC组、DM组、低中高剂量组血清SCr、BUN水平低(P均<0.05);与低剂量组比较,中、高剂量组大鼠血清SCr、BUN水平低(P均<0.05)。与NC组比较,DM组、CM组、低中剂量组肾组织匀浆SOD水平低,DM组、CM组及低剂量组肾组织匀浆MDA水平高(P均<0.05)。与CM组比较,DM组、低中高剂量组肾组织匀浆组SOD水平高、MDA水平低(P均<0.05)。与CM组比较,中、高剂量组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数小(P均<0.05)。与NC组比较,CM组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量低,中高剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量高(P均<0.05);与CM组比较,低中高剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量高(P均<0.05);与中剂量组比较,低剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量低(P均<0.05)。结论葡萄籽原花青素提取物可改善尾静脉注射造影剂糖尿病大鼠的肾损伤程度,且500 mg/kg时效果最好。葡萄籽原花青素提取物可能通过激活Nrf2—Keap1信号通路,预防造影剂诱导的糖尿病大鼠的急性肾损伤。

茶树ANR基因家族的全基因组鉴定与分析

花青素还原酶(anthocyanidin reductase,ANR)是原花青素生物合成途径中的关键酶之一,同时,ANR通过调节植物不同组织中花青素的积累影响植物对光的吸收程度和叶面温度,提高茶树的防御力和对环境的适应性。利用生物信息学分析方法,从‘舒茶早’基因组数据中鉴定出茶树ANR基因家族成员,并分析ANR家族成员的基因结构、蛋白理化性质、保守基序及顺势作用元件。结果表明,CsANR家族有21个成员,分为7类,含有多个保守基序,编码287~627个氨基酸,其中,有15个蛋白为亲水性蛋白,6个为疏水性蛋白。对CsANR家族基因的顺势作用元件分析表明CsANR家族含有光响应、防御和胁迫响应、植物激素响应(茉莉酸甲酯、生长素、脱落酸及赤霉素)和低温响应元件,说明该基因家族可能在参与植物生长发育及应对胁迫中发挥作用,本研究结果可为茶树ANR基因功能研究提供依据。

红花CtANR2和CtANR3基因的克隆、结构及表达模式分析

原花青素是植物中广泛存在的一类黄酮类化合物,是人类膳食的重要营养成分,在防治病虫害方面也发挥着重要作用,花青素还原酶(ANR)是合成原花青素的关键酶。以大果球红花品种为材料,克隆得到2个CtANR基因。生物信息学分析表明,CtANR2和CtANR3的编码区分别为1020,1023 bp,对应基因组序列中均含有5个外显子和4个内含子,第1个外显子长度不同,其余4个外显子长度一致,内含子长度差异较大。CtANR2和CtANR3基因编码蛋白质的氨基酸数目分别为339,340个,二级结构都主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,都属于水溶性蛋白,但CtANR2蛋白不稳定,而CtANR3为稳定的亲水性蛋白。此外,2个蛋白质都不存在信号肽和跨膜结构,可能定位于细胞外。序列比对及系统进化分析表明,CtANR2和CtANR1同源性最高,亲缘关系最近,3个CtANR蛋白与菊科植物ANR蛋白进化关系最近,与茄科、锦葵科和桑科植物ANR蛋白也同属一个大分支。组织特异性表达分析发现,CtANR2和CtANR1组织表达模式相似,都是在花中的表达量最高,初期果球表达量最低,而CtANR3则在苞片中表达量最高,根和初期果球中表达量最低。三者在不同激素胁迫下呈现出不同的表达模式,CtANR2和CtANR1在不同激素处理后表达量均下降,而CtANR3在5种激素处理后表达量均有不同程度的升高。以上结果表明,红花3个CtANR基因可能在红花不同发育阶段及抵抗非生物胁迫中有不同的分工。

高等植物二氢黄酮醇4-还原酶基因研究进展

花青素苷是影响植物花瓣呈色的重要色素,而花色是决定花卉观赏价值和商业价值的一个重要因素。在花青素苷的生物合成过程中,二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素苷生物合成下游途径中的第一个关键的酶。因此,DFR在高等植物花色的形成过程中发挥极其重要的作用,是形成花青素苷的一个非常重要的调控点。DFR对3种二氢黄酮醇底物具有选择特异性,但决定DFR底物特异性的分子机制目前仍不十分清楚。该文简单概述了花青素苷生物合成途径及其转录调控机制,并结合作者的工作重点综述了DFR的底物特异性以及克隆的DFR基因在植物基因工程中的应用。

芒果ANR基因的克隆及其表达分析

花青素还原酶(anthocyanidin reductase,简称ANR)基因是植物产生原花青素的关键基因,对于研究原花青素的代谢有重要的作用。根据已经报道的ANR基因的序列设计兼并引物,采用3'c DNA末端快速扩增(3'RACE)、5'c DNA末端快速扩增(5'RACE)方法,从芒果果实内克隆到1个ANR基因,其全长c DNA序列为1 201 bp。该基因开放阅读框为1 008 bp,编码335个氨基酸,等电点为5.41,分子量为36.33 ku。对基因组扩增得到了1 810 bp长度的片段,分析发现,该基因含有5个内含子,内含子位置分别为130~646 bp、733~814 bp、1 017~1 080 bp、1 259~1 349 bp、1 563~1 651 bp。通过系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白与可可、葡萄等果树具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种中ANR基因的表达进行分析发现,该基因在绿色的桂七品种中表达量较高,而在红色的贵妃品种中表达量较低。

3种果肉颜色桃原花青素积累

以瑞光19号(白肉)、浙金3号(黄肉)、红肉大红袍(DBF-基因型,红肉)桃果实为试验材料,研究了3种果肉颜色的桃原花青素积累动态及其机制。结果表明,在果实发育过程中,3种不同肉色的桃原花青素含量和积累趋势差异明显。白肉桃和黄肉桃中原花青素积累都伴随着果实成熟而降低;DBF-基因型红肉桃则恰好相反,含量随果实发育急剧升高,成熟时达到最高。无色花青素还原酶(LAR)、花青素还原酶(ANR)的酶活力及其编码基因在转录水平的表达量,分别在3种肉色桃中与原花青素积累趋势一致;在白肉桃和黄肉桃中,LAR与原花青素的积累更为密切;而在红肉桃中,ANR与原花青素的积累更为密切。

不同红光/远红光比例(R/FR)的光照影响番茄幼苗叶片中花青素合成的研究

硫灯或氙灯具有不同的红光/远红光比例(R/FR,前者为1.5,而后者为1)。研究结果表明,硫灯照射下生长的番茄幼苗叶片与太阳光下相似,能正常合成花青素;而氙灯照光生长的番茄幼苗叶片中的花青素合成受到严重抑制,通过分光光度法测定的花青素含量仅为前者的1/9。进一步在硫灯下培养红光/远红光受体(光敏素B族)单突变和双突变的番茄幼苗中,发现单突变体phyB1和双突变体phyB1phyB2的叶片花青素含量显著低于野生型,分别为野生型的1/3和1/15,由此推测花青素合成途径受到了红光/远红光比例的影响。HPLC结果又表明,硫灯和氙灯照光生长的番茄幼苗叶片中黄酮醇总量没有显著差异。我们推测氙灯下番茄幼苗花青素合成过程可能抑制位点是二氢黄酮醇还原酶或白花色素双氧酶两个催化步骤。

沙棘原花青素对6月龄糖尿病大鼠周围神经病变的保护作用及其机制

目的探讨沙棘原花青素对6月龄糖尿病(DM)大鼠坐骨神经功能、醛糖还原酶活性及抗自由基能力的影响。方法以腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备SD大鼠糖尿病模型,随机分为DM模型组,沙棘原花青素大、中、小3个剂量组,并以正常组做对照。4周后检测各组大鼠血清、坐骨神经、脑组织中醛糖还原酶(AR)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和脂质过氧化物丙二醛(MDA)的含量,并用BL-420F生物机能实验系统测定大鼠坐骨神经传导速度。结果与糖尿病模型组比较,沙棘原花青素各组大鼠血清、坐骨神经、脑组织中醛糖还原酶活性和MDA含量明显降低,而SOD、GSH-Px活性以及坐骨神经传导速度明显增加。结论沙棘原花青素对糖尿病大鼠周围神经病变具有保护作用,可能与抑制多元醇代谢通路增强和减轻自由基损伤有关。