桑树类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析

根据同源比对,从川桑(Morus notabilis)基因组数据库(morus.swu.edu.cn/morusdb/)中鉴定类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因(MaUFGT)家族成员。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析MaUFGT在桑树各组织和发育期的表达水平。随着果实发育成熟,MaUFGT1、MaUFGT2和MaUFGT3的表达模式相似,均呈上升趋势;在从顶芽依次向下不同叶位中,3个UFGT基因表达呈现先降低后升高,再降低又升高的趋势;在幼茎皮层和托叶中大量表达,幼茎表皮和木质部、叶柄中表达量较低,有的甚至不表达。MaUFGT2的表达量在3个基因中都是最高的,推测其是该基因家族的主效基因。从桑树品种‘嘉陵40’成熟果实中克隆了UFGT2基因,命名为MaUFGT2,登录号KP455729.1。其c DNA全长为1 386 bp,编码461个氨基酸,推测蛋白质分子量约为51 k D。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守性不高。将MaUFGT2克隆到p ET-28a(+)原核表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 k D,主要以包涵体形式表达,在上清液中也有少量表达。MaUFGT2蛋白经纯化和复性后,最后通过高效液相色谱(HPLC)分析该蛋白的酶活性,结果表明,体外酶活性鉴定MaUFGT2能够催化UDP葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷,验证了其具有糖基转移酶的功能。

桑树花青素合成相关基因MaLAR和MaUGAT的克隆与表达分析

无色花青素还原酶(leucoanthocyanidin reductase,LAR)是催化无色花青素转化为儿茶素的一个关键酶,是植物类黄酮生物合成路径中的一个下游酶,可抑制无色花青素在花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)的催化下转化为花青素;花青素⁃3⁃O⁃葡萄糖苷⁃2⁃O⁃葡萄糖醛酸转移酶(cyanidin⁃3⁃O⁃glucoside 2⁃O⁃glucuronosyltransferase,UGAT)是植物花青素生物合成路径中一个关键酶,其催化花青素⁃3⁃O⁃葡萄糖苷转化为花青素3⁃O⁃(2⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖醛酸基)⁃β⁃D⁃葡萄糖苷,使得无色花青素最终转化为稳定的花色苷物质而累积在果实中。通过与川桑(Morus notabilis)基因组数据库进行比对鉴定到了MaLAR和MaUGAT基因,并以粤椹大10与和田白桑的桑椹cDNA为模板克隆了MaLAR和MaUGAT基因。聚类分析结果表明粤椹大10 MaLAR与甜樱桃(Prunus avium)亲缘关系较近,和田白桑MaLAR与川桑亲缘关系较近;粤椹大10 MaUGAT与和田白桑MaUGAT均与川桑亲缘关系较近,均属于蔷薇目。实时荧光定量PCR检测表明MaLAR在和田白桑桑椹S1—S3阶段的表达水平均高于粤椹大10;而MaUGAT则在粤椹大10桑椹S2—S3阶段中表达水平显著高于和田白桑。研究表明MaLAR在桑树花青素合成途径中可能起负调控作用,而MaUGAT在桑树花青素合成途径中可能起正调控作用。

中国健康人群葡萄糖醛酸转移酶1A3基因多态性的测定与分析

目的建立葡萄糖醛酸转移酶1A3(UDP-glucuronosyltransferase,UGT1A3)一号外显子上-31T/C、-133C/T及-140T/C 3个位点基因型的检测方法,考察这3个位点的基因多态性在中国健康人群中的发生频率。方法 采用两步等位基因特异扩增法[two-step allele specific amplification(ASA)],设计葡萄糖醛酸转移酶1A3一号外显子的引物扩增基因组DNA,在此基础上针对每一个位点设立两个分别含有野生型或突变型引物的平行反应管,各包含一条3'端最后一位碱基分别与野生型或突变型配对的上游引物及一条相同的下游引物来扩增目的基因,采用1%琼脂糖凝胶电泳考察不同引物的扩增情况,以区分位点基因型,并抽样进行直接焦磷酸测序以验证方法的准确性。结果 123例(男89例,女34例)无亲缘关系的健康受试者中-31位点等位基因T和C的频率分别为0.776和0.224,-133位点等位基因C和T的频率分别为0.935和0.065,-140位点等位基因T和C的频率分别为0.915和0.085。UGT1A3*1/*1、UGT1A3*1/*2、UGT1A3*2/*2、UGT1A3*1/*4及UGT1A3*4/*4携带者分别有59名、17名、1名、12名及1名。结论 中国健康人群中葡萄糖醛酸转移酶1A3一号外显子-31、-133及-140位点存在遗传多态性;本试验建立的基因型测定与分析方法特异、准确,可满足UGT1A3遗传多态性研究的需要。

荷兰鸢尾突变株‘紫韵’的花色突变相关机理分析

为了探索荷兰鸢尾蓝紫色花及突变紫色花的显色分子机制及色素沉积差异,该研究以蓝紫色野生型‘展翅’和紫色突变株‘紫韵’为材料,通过花色素苷测定、转录组测序和qRT-PCR方法对花色变异进行分析。结果表明:(1)紫色突变株‘紫韵’花旗瓣中的总花色素苷含量(392.7μg·g^(-1))显著低于野生型‘展翅’(543.5μg·g^(-1));与‘展翅’相比,‘紫韵’有3种花色素苷含量显著下降[矢车菊素-3-芸香糖苷含量由144.42μg·g^(-1)降为46.39μg·g^(-1),矮牵牛素-3-(6-鼠李糖基-2-木糖基葡萄糖苷)含量由61.86μg·g^(-1)降为31.67μg·g^(-1),矢车菊素-3-(2G-木糖基芸香糖苷)含量由25.22μg·g^(-1)降为7.65μg·g^(-1)],但6-羟基矢车菊素-3-葡萄糖苷含量由5.88μg·g^(-1)升为10.34μg·g^(-1)。(2)RNA-seq分析共获得46530个unigenes,与‘展翅’相比,‘紫韵’有43个基因上调表达,73个基因下调表达;层次聚类分析发现,花色素苷途径中共有2个差异表达基因——查尔酮合成酶(CHS)基因(IhCHS1)和花青素3-O葡萄糖转移酶(UFGT)基因(IhUFGT1),且二者均下调表达。(3)qRT-PCR分析表明,随着花的发育,IhUFGT1在2个品种中表达量均上升,始花期达到最高,且在‘紫韵’花中的表达明显低于‘展翅’。研究认为,4种花色素苷含量的显著变化,可能是导致花色由野生型‘展翅’蓝紫色向突变株‘紫韵’紫色方向转变的主要原因;IhUFGT1基因在紫色‘紫韵’花中表达量比‘展翅’相对大幅度的降低,致使花色素苷含量相应变化,最终导致花色由蓝紫色转为紫色。