花鲈胚胎干细胞移植及嵌合体的构建

旨在通过花鲈胚胎干细胞（LJESl）移植构建嵌合体，证实LJES1细胞的体内分化能力和发育全能性。采用脂质体介导法将线性化pCMV-EGFP质粒导入到长期培养的LJES1细胞内，细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达率为5％～10％，以此为供体，通过显微注射方法把20—50个LJES1细胞移植到花鲈囊胚中，共移植囊胚478枚，获得了20枚表达GFP的嵌合体胚胎，其中的15枚胚胎发育成鱼苗。荧光显微观察和PCR检测显示了LJES1细胞可在宿主胚胎内片状嵌合和单细胞分散嵌合，嵌合部位可分布于胚体的三个胚层；同时也证明GFP是一种优良的遗传标记。本实验结果为证实LJES1细胞的发育全能性提供了有力证据。

不同因子对花鲈胚胎干细胞增殖的影响

胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期发育胚胎中分离出来的具有发育全能性的一种未分化细胞系。维持花鲈胚胎干细胞(LJES1)的体外生长、增殖及未分化状态需要在培养基中添加一些生长因子。实验通过配制省略1种或多种因子的培养基PESM0～10,计数LJES1细胞在各培养基中增殖的数量,确定各种生长因子对LJES1细胞的增殖作用。同时,对LIF因子和bFGF因子的作用进行了重点的研究,发现LIF因子对早期的LJES1细胞增殖几乎没有作用,其主要作用是维持LJES1细胞的未分化状态,但对晚期LJES1细胞的增殖有一定的作用;bFGF因子对LJES1细胞有强烈的刺激增殖的作用;鲈鱼胚胎抽提液(PEE)以及鲈鱼血清(FS)也促进了LJES1细胞的增殖,2-巯基乙醇(2-ME)具有还原血清中的含硫化合物、防止过氧化物对LJES1细胞的损害及促进贴壁的作用,因而也促进了LJES1细胞的增殖。

三种脂质体介导的花鲈胚胎干细胞转化效率的比较

通过3种脂质体(genejammer,genejuice和metafectene)介导绿色荧光蛋白基因转化花鲈胚胎干细胞,探讨不同脂质体介导的花鲈胚胎干细胞(LJES1)的转化效率,以及影响外源基因转化效率的因素,如细胞接种时间、初始接种密度、DNA和脂质体用量以及它们之间的比例等。实验发现,genejammer转化LJES1细胞效率最高,适合于该细胞系的转化。对于同一种脂质体,DNA与脂质体用量的比例对于绿色荧光蛋白基因转化LJES1最为重要,DNA与genejammer的比例为1∶6时,转化效率最高,为27.3%;DNA与genejuice的比例为1∶4时,转化效率最高,为12.1%;而DNA与metafectene的比例为1∶3时,转化效率达到最高,为5.3%。随着DNA、脂质体量的增加,转化效率有所提高,但达到一定的用量后,转化效率反而下降。